<2020第三期课程回顾>RNA甲基化生信分析

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干货 | \<4月专题第二期课程回顾>DNA甲基化生信分析

2020 CNGBdb系列公益课程开讲啦!
2020年4月24日4月专题 四节课带你玩转表观组学研究 <第3讲>上线
课程名称：RNA甲基化生信分析

讲师： 韩京华，尼奥基因组学研究院表观团队高级生信分析师。在国际知名期刊发表多篇研究论文，并获得4项软件著作权。

课程概要

1. RNA甲基化技术概述
2. RNA甲基化样本制备
3. RNA甲基化案例简析
4. RNA甲基化生信分析讲解

现场Q&A

1. Q：四项限图每个象限代表什么意思？
   A：四象限图展示的是鉴定出的peak的差异倍数（log2FC）和对应基因的表达量差异（log2FC）之间的关系。假设纵坐标是peak差异倍数，横坐标是peak对应基因的差异表达倍数，那么第一象限就表示：m6A修饰水平升高的差异peak所对应的的基因的表达量也升高。可以将既是显著差异peak，其对应的基因又是显著差异表达的这些peak用不同的颜色展示。

2. Q：motif是什么意思？
   A：motif是一段序列组成具有一定特征的功能序列。例如：转录因子会识别基因组上特定的序列并结合上去，那么这段DNA序列就称为motif。不同的转录因子识别的motif不同。对于m6A来说，m6A修饰会倾向于发生在RRACH (R=G/A; H=A/C/U)这样的序列上，那么RRACH这个序列就称为motif。

3. Q：测m6A的同时，也能进行RNA测序，对吗？
   A：是的，m6A-seq包含input和IP两个文库，input文库实际上相当于RNA-seq建库。许多文章就会利用input文库来计算基因的表达量。

4. Q：请问这里的peak和ChIP-Seq分析有什么区别？
   A：对于peak的鉴定：m6A-seq有专门的软件，如exomePeak，MeTPeak等，但也有文章会用MACS2（针对DNA IP类数据鉴定peak开发的软件）来鉴定peak。
   对于peak的注释：ChIP-seq数据一般不用区分正负链，m6A-seq数据需要区分正负链。

5. Q：能再解释下关于区分正负链的原因吗，以及不区分的话会有什么后果？
   A：基因组有正负两条链，有的转录本由正链转录而来，有的转录本由负链转录而来。一般的软件，如果不指定需要区分正负链的参数，软件就会默认用两条链或者用正链的信息来分析数据，这样就会导致分析结果不准确。例如：一个peak是负链上的，且这个peak对应的位置的正链正好有一个基因，在对peak进行注释时没有区分正负链，那么可能就会将正链上的基因认为是该peak关联的基因。

6. Q：微量m6A，需要的组织量大概是多少？
   A：不同组织需要的量不一样。一般需要提取的总RNA量在10-20ug左右。

7. Q：是否可以明确是某个具体基因转录本的m6A修饰引起的表型变化？
   A：目前的m6A-seq测序由于建库时打断片段较短，将m6A修饰关联到具体的转录本是有困难的，所以建议将m6A修饰关联到基因水平而不是转录本水平。所以仅利用m6A-seq测序数据“明确是某个具体基因转录本的m6A修饰引起的表型变化”比较困难。

8. Q：测m6A时，每组需要最少几个重复样本？
   A：目前已发表的文章使用的重复并不多（多于3重复个的很少），但有文章指出，重复样本少会导致假阳性率偏高，所以目前没有具体应该用几个重复样本的定论。
   参考文献：Alexa B. R. Mcintyre et al. Limits in the detection of m6A changes using MeRip/m6A-seq. Scientific Reports 10, 6590 (2020).

9. Q：老师，还想问下关于m6A修饰与基因表达有什么关系，一般活跃转录的基因，相应的m6A修饰水平就高吗？
   A：m6A修饰无法影响转录，因为m6A是转录后的修饰。这里说的基因表达如果指的是利用RNA-Seq鉴定得到的基因表达量：m6A在细胞核内会影响mRNA的可变剪接，在细胞质中（即经过加工的mRNA出核以后）会影响mRNA的降解，所以m6A对表达的影响是很复杂的，不能一概而论。 同时，m6A也会影响mRNA的翻译。

10. Q：m6A的也是用亚硫酸盐处理吗？
    A：m6A-seq建库不需要用到重亚硫酸盐，而是利用m6A特异的抗体将包含m6A修饰的RNA片段富集，然后针对这些片段进行测序（IP文库），同时利用input文库来矫正不同样本表达量差异。最后可以通过鉴定reads的富集（peak）来鉴定m6A修饰的位置。

审核：韩京华
图片来源：千聊直播平台页面