<2019第二期课程回顾>一小时入门转录组生信分析

课程回放：

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CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦! 2019年6月20日<第二讲>上线 课程名称：转录组分析入门 讲师：杨婷 博士/深圳华大生命科学研究院

课程概要

1. 什么是RNA：RNA 的种类、RNA 合成的部位、RNA 在细胞内的含量
2. 怎么开始RNA 项目：确定研究目标、选取合适的实验材料、选择合适的测序手段
3. RNA 信息分析主要分析内容：RNAseq、RNAref、RNAdenovo、smallRNARNA
4. 常用信息分析软件解析：组装、表达量及差异分析

RNA分析常用软件

1. 比对到参考基因组： blat，bwa，tophat, STAR, HISAT
2. 转录本的评估：cuffcompare, BUSCO
3. 基于reference的组装： Tophat+Cufflinks, HISAT+stringTie
4. De novo 组装：Oases, trinity, SOAPdenovo-Trans, Bridger 
5. 表达量：Cufflinks, stringTie, RSEM 
6. 差异分析：DEGseq, DEseq2, EBseq, NOIseq 和PossionDis, Cuffdiff

现场Q&A

1. Q：RNA有没有具体的分析流程？
   A：如果按照RNA的分析内容看，是有具体的分析流程的，比如华大就有RNAseq、RNAref、RNAdenovo、smallRNA，LncRNA. 但是在具体到每一个分析点时，有时并不是流程能解决的，因此还是需要熟悉RNA的分析工具，灵活选择。

2. Q：问一下质控的时候duplication level不过关是正常的吗？ 造成这个原因一般是什么呢？ A：这个主要看做什么分析点，如果只是做组装，不会有太大影响，去掉就好，但是如果设计表达了，就不能轻易的直接去掉duplication。 造成原因有有两点：1）建库过程引入的； 2）基因组中的多拷贝基因家族。

3. Q：duplication rate 多少反复内是正常的啊？个别样本duplication超过50%，数据可用于后续分析吗？
   A：一般高的时候能到30-50%。高duplication能否使用，主要还是考虑分析点。在做组装的时候，如果装出来的基因数量没有什么问题，reads 比对回去mapping ration没有什么问题，这个数据也是能接受的。但是对于做表达分析时，可能就要比较小心。

4. Q：如果这个转录本本身就是多拷贝的，质控的时候可以区分吗？
   A：这个很难区分，除非这个拷贝的差异还是比较明显。

5. Q：Protocol这块没出现RSEM，请问有做过横向比较吗？
   A：RSEM对于有偏向的测序reads 效果还是不错的。具体偏向是指一个基因在被测到的时候，它并不是5’到3’的均匀分布，这种不均匀的分布一般是测序导致的，软件在作分析的时候考虑了这一因素，因此软件在表达分析的时候进行了更准确的表达定量。

6. Q：一般定量时是用RSEM，FeatureCounts, 还是StringTie呢？
   A：StringTie既可以做转录本的组装也可以给出表达量的信息。做表达量的时候是一般都是采用三种标准化的过程，因此其实表达了计算我觉得不是重点，而是比对的过程，及标准化的差异。

7. Q：rsem-prepare-reference提取的转录本和gencode下载的不一致取信哪个呢？
   A：你提到的这两个软件我没有直接比过，我们日常使用的提取转录本都是我们自己写的程序，我们的一般流程：先通过各种方式构建了一个转录本，提出后会对转录本之间做比较，常规判断：两个转录本之间有多大程度的overlap，转录本是否有正常的起始，是否有正常的功能等。

8. Q：多少数据量可用于转录本可变剪接分析？
   A：对于可变剪接，一般我们都会把reads mapping回去，同时提取有效的可变剪切位点信息。但是也是有经验值的，以植物为例我们要求在8G左右的测序量。

9. Q：差异基因很多怎么办？
   A：差异基因很多的情况下，我们一般都会做火山图或MA图来看一下背景情况，如果背景干扰本身就很大，可考虑过滤步骤是否没有做好，建议您可以做一个多重校正。

10. Q：饱和度是怎么计算呢，抽取数据吗？
    A：饱和度是分不同等级、不同数据集做mapping，直到基因增加不影响cover情况，说明数据基本是饱和的。

11. Q：可变剪接分析是用来比较同一个样品不同处理或不同器官的吗？
    A：这只是可变剪接分析的一方面，可变剪接是基于参考基因组，参考基因组会有一个基因集，基因位置是已知的，不同组织部位在基因表达后会有一些剪切形式，可变剪接是对于参考基因集来说基因表达后有哪些变化。

12. Q：有一个物种很多RNA测序，可不可以用这些转录组数据，比对基因组后用DESeq2比较表达量无差异的基因以确定内参基因呢？
    A：不建议这么做，对于转录组来说，虽然来自同一物种，但是在不同表达情况、不同生长环境、不同数据量和采样时间等都有很大差别，如果只是为了寻找内参，做管家基因的表达分析，可以大致看一下。

13. Q：可变剪接分析需要生物学重复吗？
    A：基本上不需要生物学重复，除非是同一环境下的反复采样，其对于转录组分析的意义不大，因为对于有很大影响的可变剪接后期还是会做验证。

14. Q：可变剪接分析用于那些领域，老师能几个例子说明下吗？
    A：例如在基因组学上，有两个非常接近的物种，在基因组上有一个相同的基因，但是在做表达的时候发现有不同的剪接形式，这个剪接形式直接导致了翻译的蛋白进入了不同的pathway，产生特殊功能，这就是基因相同最终代谢物不同的原因。

15. Q：请问下从火山图上怎么看背景的干扰程度？直接用DEGseq做的
    A：正常情况下火山图是在中间没有差异表达的会非常多，越往两边应该是慢慢变稀疏，如果怀疑做差异表达出现问题，这个火山图会出现不规则性，不会有两边少中间聚集的情况。

16. Q：转录组测序测多个样本来比对更准确还是单样本测序就可以呢？
    A：这个与项目类型相关，如果做转录组的组装只是为了基因组的注释，这种情况没有必要做多样本重复，但是对于做表达分析来说，需要样本和技术重复。

17. Q：以前用Genbank时，看到一个基因有多个大小不同转录本，如何判断他们是组装产生的，还是可变剪接导致的？
    A：可能不是组装造成的，而是注释造成的，我们在得到一些转录本后，原则上我们会选择最长或者和基因组特点最接近的转录本做注释，在上传数据的时候一般很少允许gff文件之间有overlap的情况。

18. Q：软件怎么获得？
    A：在github来源软件库下查找软件，然后打包下载即可；或者直接网页搜索。

19. Q：不同品种都只做了一个时期的转录组，没有重复，请教该如何分析能发一篇文章？
    A：你这个问题非常抽象，如果这个时期对于这个物种来说没有什么意义，那他就是独立的转录组分析，您可以装出unigene，然后构建一个这个物种的pan 基因库，找一找每个物种共有的和特有的，做个功能分析也可以发文章。

20. Q：做火山图的目的到底是为啥？
    A：简单点说是为了看，表达差异的基因的显著性。

审核：杨婷