热点综述 | 健康和疾病中的空间转录组学

空间转录组技术的快速发展加快了包括肾脏病学在内的多个领域的发现步伐。2024年5月，《Nature Reviews Nephrology》发表综述文章，概述了当前和新兴的空间转录组学方法、其应用以及该领域仍面临的挑战。

空间转录组学是指组织中mRNA表达的定位和/或测量。它是通过RNA转录物的直接原位成像或通过将空间信息（通过从组织学组织切片中获得的精确坐标的共同配准）与来自同一组织的RNA测序数据相结合来实现的。空间转录组技术为我们理解健康和疾病状态下的生物相关细胞组织提供了巨大的潜力。在过去几年中，空间转录组技术的快速发展使得能够以亚细胞分辨率对多个RNA靶标进行分子测量。迄今为止，这些技术被用于：验证单细胞测序发现的新细胞类型的身份；以提供关于所识别的细胞类型的空间信息；对功能组织单位内的细胞-细胞或邻域关系产生新的见解；揭示健康和疾病环境中先前未被重视的生态位多样性；并为相邻细胞之间发生的配体-受体分子相互作用提供机制见解。因此，空间转录组技术现在代表了生成健康器官细胞、分子图谱和疾病细胞、分子图谱的各种技术手段的一个组成部分。

此篇综述概述了空间转录组学的方法、分析和应用，重点关注与健康和疾病中肾脏生物学相关的方法、分析和应用。

空间转录组学技术

空间分辨转录组学技术允许以多种方式在单细胞或接近单细胞分辨率下对转录本进行空间定位，目前包括基于测序的技术和基于成像的方法。基于测序的技术包括全转录组原位捕获和基于目标区域的空间RNA分析平台；基于成像的技术包括各种大规模多路原位杂交方法。

空间转录组学分析方法

空间转录组技术发展迅速，需要开发出能最大限度地从原始数据中提取生物学见解的分析方法。空间转录组数据输出可大致分为三类：空间环境中细胞类型的定位；空间可变基因（SVG）的确定；以及功能相关邻域的建立。为实现这些数据输出，分析流程必须从细胞类型的分子定义开始，该定义可从文献或单细胞或单核 RNA 测序（scRNA-seq或snRNA-seq）数据中收集，然后进行标签转移，即根据 scRNA-seq（本文中指scRNA-seq和snRNA-seq）数据中的基因表达谱对细胞身份进行了解，并通过转移学习对空间转录组数据中的细胞进行注释。由于一些空间转录组学方法（例如Visium和GeoMx）不是单细胞分辨率的，而且空间定位的mRNA由不止一个细胞贡献，因此可以根据scRNA-seq数据中的知识，使用去卷积方法来确定这些区域中的细胞身份。每个细胞的空间识别依赖于分割，根据细胞核或形态标记推断细胞边界，最终推算出组织中每个细胞的mRNA。

与其他技术整合

与其他组学整合

没有一种可用的空间转录组技术能够单独建立器官的全面分子图谱。尽管空间转录组分析的数据输出可能是稳定的，但如果没有正交转录组、蛋白质组或表观基因组分析数据的多模式整合，它们是不完整的。需要多种模式来定义细胞的身份，从而定义细胞的功能。

蛋白质表达数据与空间转录组信息的整合对于解释细胞类型、细胞状态以及将 RNA 分子归因于正确的细胞非常重要。由于这些组合的空间蛋白质组学和转录组学技术最近才得到优化，研究团队通过索引联合检测（CODEX）等多重空间蛋白质组方法，结合空间转录组技术，对人体肾脏组织样本的连续切片进行检测。然后，通过排列共同的蛋白质组和转录组邻域，在分析空间对空间数据输出进行比较，或通过共配准在物理空间对空间数据输出进行比较，以辨别蛋白质和 RNA 之间的关系。另一项关于人类肾乳头53 的研究绘制了健康参考组织和草酸钙肾结石患者组织中的基因和蛋白质表达图谱。该研究利用co-registered空间蛋白质组学和转录组学确定了结石形成者的矿物质沉积区域，确定了矿物质周围区域的局部免疫细胞浸润以及 MMP7和MMP9 RNA 表达的上调。

空间表观遗传学是一项新兴技术，可以增强仅从空间转录组学获得的信息。标准 ATAC-seq（转座酶可及染色质测序分析）允许测量组织 DNA 中的开放染色质，这有助于了解基因表达的调控。现在还可以使用空间 ATAC-seq 直接从 DNA 原位测量染色质可及性，将开放染色质定位到组织内的细胞和组织单位。尽管据研究团队所知，空间ATAC-seq尚未应用于肾脏样本，但使用基于mRNA的空间转录组学和多组学分析获得的标准数据集(即结合scATAC-seq和scRNA-seq数据)，信息学方法可用于推断转录因子与其调节mRNA表达的细胞类型之间的表观遗传关系。

与组织病理学整合

理想情况下，所有空间转录组输出都将以潜在的组织病理学为基础，并将帮助病理学家进行解释。然而，手动注释肾活检样本中的每个细胞需要付出的努力既昂贵又费时。因此，使用机器学习或人工智能(AI)来总结像素级特征的数字病理学工具的发展代表了一个重要的进步，例如于2023年底发布的工具FUSION，用于将人工智能注释的功能组织单元与整个样本的空间转录组数据联系起来。

然而，尽管人工智能的发展很重要，但随着数字病理学和空间转录组学的整合进展，必须考虑一些注意事项。首先，病理学家习惯于从包埋在FFPE中并以2-3 µm厚度切割的样本中解读活检组织。越来越多的空间转录组学平台已被优化，以提供来自FFPE组织的转录组学特征，但并非所有平台都具有这种能力。此外，许多空间转录组技术已针对5-10µm厚的切片进行了优化，这比大多数病理样本厚三到五倍。 较厚的切片会使肾小球和小管等功能性组织单元看起来像是超细胞，这可能是将空间转录组数据输出与标准组织病理学评分标准联系起来的障碍。薄切片可以用于空间转录组学，但样本的厚度和检测到的RNA分子数量之间存在权衡。一种解决方案可能是以2-3µm的厚度连续切割组织学切片，并对图像进行配准。

在实验模型和人类肾脏疾病中的应用

来自实验模型的机制见解

肾脏是一个复杂的器官，附近有不同的细胞类型和功能组织单位。这些不同的细胞在正常的生理条件下进行交流（例如，致密斑细胞和肾小球旁器中的肾素产生细胞进行交流以调节重要的肾功能，如肾血流量和肾小球滤过）或在损伤情况下进行通信（例如，如免疫、基质和上皮细胞的相互作用所示（图4））。空间转录组学有可能促进我们理解这些相互作用发生的空间锚定邻域，补充来自单细胞和单核转录组学的分解特征。事实上，空间转录组学已经应用于肾脏疾病的许多模型系统（包括脓毒症和 IRI模型等），以探索细胞类型和损伤状态的原位定位。

在人类肾脏疾病中的应用

KPMP、HuBMAP、Neptune、CureGN和 Trident等肾脏联盟正在积极开发肾脏细胞图谱，这些图谱需要对细胞类型和状态进行空间定位。例如KPMP–HuBMAP合作使用10x Visium ST平台与Slide seq相结合，在空间上解析和验证了从损伤肾组织的scRNA-seq分析中鉴定的70多种细胞类型和状态；2022年的一项研究使用10x Visium绘制了糖尿病肾病、高血压或无肾病患者的纤维化空间微环境图。

Slide-seq的更新版本Slide-seqV2已用于识别健康人肾皮质和髓质中的邻域，包括 LYVE1+巨噬细胞的生态位。人类和小鼠肾脏研究结果的重叠对于理解人类疾病的哪些方面可以建模是重要的。相关研究通过比较不同肾元结构和微血管区域的空间基因表达特征，利用Visium研究了人和小鼠之间的物种差异。

除了图谱构建工作外，空间转录组学已被证明对移植肾的研究有价值，部分原因是衍生的空间转录组邻域有助于优先检查哪些免疫-上皮细胞相互作用。例如一项研究使用GeoMx平台评估了具有T细胞介导的排斥反应的同种异体肾移植物和健康对照活检样本中受损上皮和浸润免疫细胞之间的关系。

大多数人体组织图谱构建工作都使用 ISC 技术或 GeoMx 来锚定组织内的细胞类型和状态。尽管 CosMx、Xenium 和 MERFISH 等空间分辨转录组学方法尚未完全融入临床应用或用于提供对疾病生物学的见解，但质量控制的可行性研究（包括肾脏研究）已有报道。这些研究为未来将多重ISH技术用于临床活检组织的检测铺平了道路。

存在的限制和挑战

尽管可用的空间转录组学工具数量有所增加，但它们的高成本可能会限制用户对它们使用。这些技术的主要数据集数量有限，也限制了我们对其优缺点的了解，以及在考虑组织、保存和处理方法的情况下，就哪种技术最适合特定应用做出明智决定的能力。在分析方法的选择以及与蛋白质组学等其他模式的整合方面也存在挑战。对于这些工作以及提高人们对利用空间转录组学获得的结果的信心至关重要的是，需要建立质量保证和控制标准，并实现各种检测方法之间的协调统一，以生成可查找和可互操作的数据集。

尽管空间转录组学领域的技术进步、采用和数据生成正在增加，但分析、数据存储和共享方面的挑战越来越明显。以单细胞分辨率覆盖整个基因组的能力即将实现，但由于转录水平从罕见到高表达的动态范围，这仍然是一个挑战。商业工具提供了优于为个人实验室内部使用而开发的工具的优势，因为它们提供了标准化和质量控制的产品；然而，大规模采用商业工具可能会使单个实验室的成本过高。相反，单个实验室开发基于FISH的分析可以降低这些成本，但这些工具受到其有限的通量、缺乏标准化、缺乏改进技术的资源、训练有素的人员的流动以及可能影响互操作性的技术变化的限制。值得注意的是，需要进行基准测试来评估非商业性测定的性能，因为尚未进行对照实验来比较不同空间转录组平台的性能，这些平台在相同组织类型上使用相同的探针组，具有不同的保存方法或组织厚度。这些数据对于描述不同方法最好覆盖的条件和目标以及提供关于每种方法的优点和缺点的信息至关重要。HuBMAP倡议正在与几个肾脏图谱项目合作，解决成人肾脏的一些问题。

尽管有针对性，但空间分辨技术将越来越多地获得亚细胞分辨率和更高的多重性。需要解决的一个限制是有限的成像区域。当前技术的成像面积＜3 cm2，因此不适合于较长的组织切片。此外，每次成像运行的通量很低（在同一次运行中只能对几张切片进行成像），但仍需要数天的成像时间。这里的额外挑战是，每个样本的成像数据可能是几百GB，因此可能需要专用的主动存储和分析计算能力（例如几百MB的快速访问存储器和快速处理器）。空间转录组技术的分析工具仍处于早期阶段，用户可能必须测试不同的工具（例如分割、邻域和邻近度分析），以确定对给定任务最有用的工具。例如关于分割，在定义细胞边界、捕获缺失的细胞和分离高细胞密度区域中的细胞方面仍然存在相当大的挑战。在探针设计中，高表达基因（如UMOD）可能使信号饱和，必须省略，在设计靶区期间，必须降低其浓度或使用较低数量的探针来靶向该基因。需要改进的其他限制是在生成空间转录组数据的同一切片上进行组织学的共同配准，因为在空间转录组实验完成后可能无法保留形态学，以及每张切片的成本。对于基于测序的技术，公开共享原始数据需要纳入控制访问和保护患者机密的措施。其他基于探针的平台，如Visium FFPE、CosMx和Xenium，不直接读取RNA序列，可能对数据共享有较低的障碍。一个主要挑战是如何以简化的方式使数据可供领域使用，以便以交互方式用于假设生成和测试。需要考虑的一个重要点是，大多数概念验证数据都是在2D中进行分析的。与2D相比，3D空间转录组学提供了更准确、更深入的细胞邻域和亚细胞定位信息，但数据存储、分析、共享和可用性越来越复杂。预计近期的进展将促进空间转录组学的发展，并能够在细胞水平上同时询问蛋白质、染色质和基因表达。然而，临床应用的进展需要与组织病理学家密切合作，将颗粒分子途径与异常组织学区域联系起来。此外，还需要与临床医生合作，为异常分子病理学确定合适的药物靶点，并从空间转录组数据中生成证据，以优化现有药物的治疗选择，类似于肿瘤学家如何将生物或化疗选择建立在肿瘤活组织检查的基础上。

考虑到数据集和工具的技术复杂性、可变性以及空间转录组实验中的分析挑战，建议制定指南，以确保空间转录组数据集符合FAIR数据原则（即，它们可被人类和机器发现、可访问、可互操作和可重复使用），并受到质量控制。在预分析步骤中，建议保持细致的元数据记录，特别是有关分析试剂盒版本、组织保存方法和组织处理流程的信息。如果无法进行联合配准的组织学染色，鼓励研究人员使用自体荧光获得伪组织学图像。至少，组织学需要相邻的切片。还建议采用解剖结构、细胞类型和生物标志物的标准化命名法（ASCT+B），具有清晰的本体术语，领域内可以很容易地解释，以促进单细胞转录组数据与空间转录组学的整合。强烈建议在每批中运行一个对照组织样本，最好是在与查询样本相同的载玻片上运行一个小组织样本，以监测测定漂移和测定性能，并为技术和生物再现性建立可接受的参数。应通过公共数据存储库向领域提供ROI或视野的图像，并应清楚地表明所使用的标记基因和阈值。最后，应免费提供用于分析的代码，包括分割和插补等。

空间转录组学技术的强大功能及其与其他多组学检测方法的同步使用已开始揭示肾脏细胞和空间组织与整个生命周期中健康和疾病状态下基因表达的潜在变化之间的关系。在技术、应用和分析工具方面的一些改进正在酝酿之中，预计这些改进将迅速被肾脏界所接受，其中一些发展将改变我们对肾脏生物学和临床应用的理解。例如，通过空间转录组数据等共同锚连接多层多组学技术，在共存组织学图像上进行训练的深度学习工具可实现基于光学显微镜图像的分子特征的人工智能预测。开发分析工具，对包括代谢组学或脂质组学数据在内的多种数据模式与空间转录组学数据进行分析，将为了解功能性组织单元的细胞和邻域特性提供更多的信息。能够构建3D空间转录组图谱的新技术也在开发中。例如，STOmics是一种新技术，使研究人员能够在单个组织样本中进行组织、细胞、亚细胞和分子水平的空间转录组分析。此外，能够对检测到的RNA分子进行细分解析的发展将提高对细胞不同区域（如细胞核和细胞质）的基因调控动力学和RNA动力学的理解，并识别细胞不同区域内的基因调控微生态位。应用空间转录组技术来提高对肾脏生物学的理解无疑是变革性的。迄今为止的进展证明，肾脏界已经做好了应对挑战的准备，此外，通过建立高质量控制和严格的标准，以及开发空间图谱和工具，肾脏界可以为更广泛的研究界树立榜样，这些图谱和工具已成为将空间转录组技术应用于复杂固体器官的模型。

参考文献Jain, S., Eadon, M.T. Spatial transcriptomics in health and disease. Nat Rev Nephrol (2024). https://doi.org/10.1038/s41581-024-00841-1