科研“出圈”必备——空间组学技术

空间组学技术正在提供一个新的视角。通过量化数十到数百个基因、转录物或蛋白质，空间组学能够在自然组织或细胞结构的背景下收集有价值的分子、细胞和微环境信息。

2020年5月，来自美国的研究人员在《Matrix Biology》发表综述论文，概述了目前可用的空间转录组学和空间蛋白质组学方法，并进一步描述了应用这些方法来提高对细胞外基质（ECM）和成纤维细胞生物学的理解的最新研究。

空间组学技术

最近在技术和工艺上的进步使得组织切片中RNA转录物的原位可视化成为可能。空间转录技术将多重成像扩展到100~1000s转录本，并可以通过测量预先确定的目标或收集全局表达数据来区分。

预先确定的mRNA目标的成像

对单个RNA物种成像的第一个实例可以归因于单分子荧光原位杂交（smFISH），它提供了RNA分子在细胞内的拷贝数和定位的绝对定量，smFISH有助于低丰度RNA的成像。

由于smFISH受到可用荧光通道数量的限制，需要更为灵活的操作。seqFISH是一种多路smFISH方法，通过连续几轮杂交、成像和探针剥离，多次检测单个转录本。

为了弥补seqFISH的大量耗时，2015年发布了MERFISH技术。2019年发表的一项研究将支链DNA扩增整合到MERFISH流程中，以增加信号而不改变荧光斑的大小，这将增强更短的RNA成像并提高成像通量。

滚环扩增（RCA）用于另一种空间转录组学技术，称为ISS。该方法使用挂锁探针来靶向已知基因。在完整的组织切片内，mRNA首先被逆转录为cDNA，挂锁探针可以结合到其上。挂锁探针是一种单链DNA分子，含有与目标cDNA互补的区域。

ISS利用挂锁探针来提高靶结合特异性，允许检测非编码和microRNA，但是生产成本昂贵。为此，相关研究人员开发了邻近连接原位杂交（PLISH）通过用RNA模板邻近连接取代挂锁探针来降低成本并提高可扩展性。

STARmap使用条形码挂锁探针，与靶标杂交，但通过添加第二个引物，针对挂锁探针旁边的位点，避免了逆转录（RT）步骤。这种方法避免了cDNA转换的效率障碍，并通过增加第二个杂交步骤来降低噪音。

基因组级别的转录组测序

对于需要无偏倚基因选择的实验，建立了评估整个基因组的空间转录组学方法。ISS是靶向方法的一个主要例子，FISSEQ是一种非靶标的方法，即捕获所有种类的RNA。虽然FISSEQ能够直接对组织内的多种转录物进行测序，但其他无偏倚的空间转录组学技术依赖的方法允许它们使用批量或单细胞RNA-seq并将结果映射回先前的图像。激光捕获显微切割（LCM）是一种利用激光束在显微镜下切割组织区域的技术。10X Genomics公司的Visium检测法在分辨率（直径55µm，条形码区域之间的距离更小）以及运行时间上都有改进。这种方法捕获的转录物数量是LCM-seq的两倍。

代替在玻片上打印区域条形码RT引物，人们可以将它们附着在溶液中的珠子上，然后将它们分配到玻璃表面。这一方法是由Slide-seq技术的研究团队在2019年采用的。与其他原位方法相比，组织图像是从相邻切片获得的，而不是从相同的切片获得RNA数据。Slide-seq具有很高的可伸缩性，可达到10μm的空间分辨率，可以探测单个细胞内的局部基因表达。

空间分辨的蛋白质组学

由于RNA降解、转录后、翻译和翻译后修饰，RNA和其对应的蛋白质不是以1:1的比例表达的，因此必须对蛋白质及其浓度、相互作用和位置进行评估。为了实现这一目标，已经开发了许多技术，我们将其分为：1）需要组织解离的方法，并依赖于计算图谱技术；或2）保留组织样本的方法，通常以降低测序深度为代价。

需要组织解离的方法

最初于2014年提出的成像质量流式细胞术（IMC）是一种能够以1微米分辨率记录蛋白质分布的方法。多路离子束成像（MIBI）在组织切片内的单个细胞中以二维方式分析多个参数，也利用质量标记抗体分析高度复合蛋白表达模式与形态学背景。

成千上万的分子，包括代谢物、脂类、肽、蛋白质和聚糖，可以通过使用质谱进行无偏倚分析。空间靶向光学显微蛋白质组学（STOMP）将质谱（MS）和亲和光标记技术结合起来，以充分利用全局空间蛋白质组学的方法。 MS方法是空间蛋白质组学的一个有价值的工具，因为它们允许对多种分析物进行无偏倚分析以及翻译后蛋白质修饰，如纤维连接蛋白的瓜氨酸化，这被证明可以改变成纤维细胞的粘着稳定性。然而，与光学成像相比，这些方法的分辨率经常受到影响，以适应小面积低丰度物种的MS仪器灵敏度。

保存组织完整性的技术

为了保存形态学背景并提高分辨率，已经开发了许多方法来调节标准抗体标记以呈现高维数据，例如基于组织的循环免疫荧光（t-CyCIF），其优点是它使用了常用的试剂、允许z-stacking的常规显微镜和可以选择满足特定研究的商业抗体。另外，CO-Detection by indEXing (CODEX)工作流程有利于在由整个抗体panel组成的单一抗体孵育期后对多达40个抗原进行成像。

值得注意的是，MIBI、t-CyCIF和CODEX的设计旨在评估单个细胞，尚未应用于厚度超过10µm的组织切片。这些工具将有助于进一步探测已知的位置依赖性蛋白质-蛋白质相互作用。

多元空间组学

为了在多个分子水平上获得组学数据，很少有技术能同时对RNA和蛋白质进行多重成像。CITE-seq和REAP-seq等技术将蛋白质组学信息与RNA-seq相结合，但缺乏空间背景。最近的研究已经能够实现3个mRNA和16个蛋白质的成像，同时具有单细胞分辨率。GeoMx公司™ 数字空间分析（DSP）（Nanostring Technologies，Inc.）系统扩展了其方法，以适应40个蛋白质和多达900个mRNA探针的多路复用，以同时分析空间分布，理论上可以扩展到最多96个抗体和无限数量的RNA测序。

多组学及空间组学技术在基质研究中的应用

ECM蛋白的生化特性与细胞内不同。ECM蛋白的高度修饰和交联特性不仅赋予了其在组织和细胞水平上抵抗拉伸或压缩应力的能力，而且对用常规生化方法研究这些蛋白质提出了挑战。

基于质谱的组织ECM分析方法

与转录组学工具相比，蛋白质组学工具的灵敏度较低，这使得进行实验所需的肽的数量更加复杂。为了规避这些挑战，研究人员已经开发了富集和溶解ECM蛋白的方法。虽然方法之间存在细微差别，但它们都遵循类似的流程：ECM富集、蛋白质溶解和消化成肽，然后进行质谱分析。定量的去垢剂溶解度分析（QDSP）技术可以进一步扩展ECM蛋白的分析。如前所述，对ECM进行的大多数研究都涉及通过去除更多可溶性细胞成分来富集不溶性ECM，从而在过程中产生含有更多可溶性蛋白质的多个组分。对所有组分（而不仅仅是富含ECM的组分）的分析可以揭示疾病进展或衰老过程中影响ECM蛋白组装和交联的机制。例如，高通量降解技术和蛋白质组学方法能够扩展我们对基质金属蛋白酶切割特异性的认识，从而确定基质金属蛋白酶的调节作用并设计更有效的治疗方法。

组织或细胞的转录组学和蛋白质组学特征可以结合在多组学研究中。这种整合可以揭示健康和疾病组织中不同水平的调控（转录、翻译和翻译后）。例如使用多组学方法研究博莱霉素诱导的损伤和衰老背景下的小鼠肺组织。当基因表达水平和蛋白质丰度不相关时，这些方法特别有用。结合蛋白质组学分析中发现的溶解度和丰度的变化，上游调节因子的转录组学分析可以提供基质的系统生物学观点。最近有研究者尝试将miRNA数据整合到转录组和蛋白质组数据中，其中一项研究检测了IPF和硬皮病患者肺成纤维细胞的mRNA和miRNAs谱，揭示了miRNA、ECM基因和ECM蛋白表达水平的特异性纤维化特征。

ECM组成和体系结构的区域特征探讨

上述研究极大地促进了我们对ECM复杂性的理解，并揭示了多种细胞类型和亚型，这些细胞类型和亚型可促进健康和疾病组织中ECM的产生和重塑。然而，由于它们的破坏性，上述方法不允许研究人员探测ECM的组织异质性。为了克服这一点，各种方法将重点放在分离目标区域上，以便捕获和评估较小的细胞群或特定的微环境，否则这些细胞群或微环境将在样品的批量处理过程中丢失。LCM是其中一种方法，因为它允许从组织载玻片上手动选择特定区域进行分析。

另一种表征ECM蛋白在组织内分布的定位和模式的方法是ECM图像质谱（ECM-IMS）。早期利用ECM-IMS的研究之一旨在发现区分年轻和老年皮肤样本的ECM特征。在最近的一项研究中，研究人员利用飞行时间（CyTOF-flight，CyTOF）流式细胞术（cytometry）分析了在2D、3D或体内生长的肺癌细胞中的蛋白质表达变化，在研究中使用的12个标记物中Galectin-3是一种基质相关蛋白。

重要的是，为了充分了解ECM的复杂性，除了分析其生化组成外，还需要以时间和区域解析的方式确定其结构组织以及生物物理和机械特性。

多重空间组学将有助于通过从多个空间尺度获得信息来揭示细胞复杂性，有助于理解整体细胞表型/状态，细胞与细胞之间的相互作用，以及这些分子特性如何与各自的组织结构相联系。然而，空间组学技术还需要继续提升和发展，例如在基于空间图像的蛋白质组学中，每个图像周期的构建库受到条形码、荧光染料或稀有金属等数量的限制；目前的空间组学方法都不能在活体外或活体内对活细胞进行多重空间组学研究等。

参考文献
Bingham GC, Lee F, Naba A, Barker TH. Spatial-omics: Novel approaches to probe cell heterogeneity and extracellular matrix biology. Matrix Biol. 2020 Sep;91-92:152-166. 
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