临床蛋白组综述 | 如何利用蛋白组学技术进行癌症临床研究？

肿瘤基因组和转录组的分析现在已经成为发现新生物标记物的工具，但是蛋白质组表达的改变更可能反映肿瘤病理生理学的变化。过去，临床诊断依赖于基于抗体的检测策略，但这些方法有一定的局限性。质谱（MS）是一种强有力的方法，使人们越来越全面地了解蛋白质组的变化，从而推动个性化药物的发展。

来自加拿大多伦多大学健康网络玛格丽特公主癌症中心的研究人员在《Clinical Proteomics》杂志发表了基于MS的临床蛋白质组学研究进展，特别关注了癌症研究。研究人员详细概述了临床样本类型、样品制备技术、质谱配置、蛋白定量策略以及癌症组织/体液蛋白组学的研究进展。

临床蛋白组学方法概述

研究人员对临床样本类型、蛋白纯化方法、质谱配置、蛋白定量策略等方面进行了详细描述。

临床样本类型：1）对临床组织的直接蛋白质组学研究越来越普遍，保存组织样本的方法一般有新鲜冷冻（FF），福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和最佳切割温度嵌入等。从蛋白质组覆盖率的角度来看，FF是首选的保存方法，但FFPE组织已经储存了几十年，为临床蛋白质组学提供了广泛的临床随访和宝贵的资源。组织样本可以通过激光捕获显微切割（LCM）进一步制备，以增加空间分辨率元素。2）非侵入性或微创方式（即液体活检）获得的临床样本是研究新生物标志物的理想样本。最常被分析的生物体液是血液（血浆、血清）和尿液，其他体液包括前列腺分泌物、唾液、眼泪、脑脊液（CSF）和腹水等。

临床样本制备：蛋白质组学样本制备尚无统一的方案，但应根据蛋白质组的复杂程度、样品的可利用量和研究目标对所选择的策略进行优化/选择。MS样品制备的第一步包括从临床样品中分离和提取蛋白质。这包括提取试剂，如不同的有机溶剂和洗涤剂，然后是组织破坏技术，如冻融循环、超声或机械破坏，以最大限度地提高蛋白质提取和溶解。最近开发了不同的蛋白质纯化技术，如FASP, MStern，S‑trap，SP3，iST等，减少了蛋白质消化时间要求，并将样品损失降至最低，提升整体操作效率。

质谱配置及扫描模型：ESI依赖于成熟的反相纳米LC技术或与毛细管电泳相结合，对基于发现的实验更为实用。正交肽分离技术在临床蛋白质组学研究中的应用越来越广泛。为了提高蛋白质组的覆盖率，可以通过碱性反相液相色谱或强阳离子交换色谱分离肽池。大多数基于发现的临床蛋白质组学研究仍然使用基于数据依赖采集模式（DDA）识别潜在的生物标志物或获得生物学见解，目前临床蛋白质组学领域正在向数据非依赖采集（DIA）转变。

蛋白定量策略：一般来说，相对定量策略用于基于发现的临床蛋白质组学。相对定量通常依赖于稳定同位素标记的使用，从而产生共价衍生肽，如SILAC，比较新的策略有TMT和iTRAQ。目标蛋白被鉴定出来后就需要进一步验证，虽然基于抗体的技术（如ELISA）履行了这一职责，但基于MS的靶向检测非常适合于验证，尤其是在没有合适的抗体可用的情况下，最常用的方法是多重反应监测（MRM）质谱，新技术有平行反应监测（PRM）质谱。

临床蛋白组学在癌症研究中的应用

组织样本

“发现类”基础研究：使患者肿瘤组织的常规蛋白质组学分析已成为发现生物标记物、生物途径以及与现有基因组/转录组整合研究的重要手段。基于组织的蛋白质组学策略已被应用于许多癌症类型的研究，包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、卵巢癌和口咽癌。一般研究思路为将癌组织样本与来自同一患者的“健康”相邻对照组进行比较，以寻找潜在的诊断生物标志物。同时，比较不同阶段癌症患者的预后信息。一旦确定了少量的候选蛋白质，通路分析就可以深入了解这些蛋白质是如何与肿瘤发生、增殖、转移和其他癌症驱动过程相关的。随后通常采用基于抗体的技术，在较大的独立队列中补充/验证差异表达结果。

靶标/多位点验证：迄今为止，组织蛋白质组学研究主要集中在基于发现的基础研究上，这些研究揭示了很多潜在的癌症标志物。后续需要朝肿瘤常规分析的方向，开发有针对性的MS检测方法，比如组织裂解物的PRM，将成为更主流的方向。

关注蛋白组学中的空间分辨率：量化组织蛋白质组变化时需要考虑的一个因素是肿瘤的异质性。研究人员正在努力区分源于疾病进展的蛋白质表达的变化，以及那些源于组织异质性和次生生物学途径的变化，激光捕获显微切割（LCM）的发展为分离肿瘤横截面的特定区域提供了一个强有力的工具。质谱成像（MSI）技术也提供了空间信息并显示了其在临床上的潜力。此外，肿瘤的异质性使得蛋白质组学需要单细胞分辨率，一种基于MS通过将抗体探针耦合到独特的稳定重金属同位素的“质量细胞术”，允许在单个细胞中监测几十种蛋白质标记物。

多组学分析：虽然许多癌症的基因组和转录组已经被很好地阐明，但是癌症蛋白质组及其与上游基因组改变的关系却鲜有文献记载。近年来，越来越多的研究开始整合各级组学数据来描述肿瘤的综合多组分评估。未来，蛋白质组数据集与基因组水平数据的整合将在未来肿瘤学和个性化医学研究中变得越来越普遍。

体液样本

在临床实验室检测中，血液是最广泛用于疾病诊断、预后和治疗结果的体液。2002年启动的人血浆蛋白质组计划（HPPP）旨在通过MS生成一个人类血浆和血清蛋白质组的开源数据库。

尿液是另一种常见的采样人体体液，因为它产生量大，可以很容易地以非侵入性的方式收集。70%的尿蛋白来自肾脏和尿道，这是一个很有价值的尿路监测资源；剩下的30%的尿蛋白来自肾小球对血液的过滤，这表明尿液也可以帮助我们了解远处器官的癌症。同时，尿液是前列腺癌生物标志物的重要来源。

除了血液和尿液外，还有多种可供选择的人体体液有可能被用来发现生物标志物，例如脑脊液作为一种有价值的生物标志物来源不能被忽视，因为它最近被证明含有超过3300个总蛋白，并在大脑特异性蛋白质中富集。后续这些替代体液蛋白质组将被进一步详细描述，作为寻找强有力的非侵袭性癌症生物标志物的一部分。

总结

由于标准化、高通量的样品制备技术，临床蛋白质组学领域可能会在临床队列规模上迅速扩大。这将最大限度地减少因统计不足而导致的研究频率，并提高将候选生物标志物和药物靶标转化为临床应用的效率。蛋白质组学将越来越成为癌症系统生物学的重要组成部分，它整合了基因组学、表观基因组学、转录组学和PTMs的多组学数据。这将要求更高的计算能力来处理和分析日益庞大的数据。质谱仪灵敏度和速度的进一步提升将使蛋白质组的深度覆盖更加有规律，尤其是不需要进行大量的预分离。检测/定量水平的提高也将使临床蛋白质组学向最小输入样本量和单细胞蛋白质组学方向发展。最后，数据分析流程优化将提供更多的诊断和预测准确性相对于单一的标志物。这些进展都是基于MS的临床蛋白质组学所必需的，以充分发挥其将研究发现转化为临床实践改进的潜力。

参考文献
Macklin A, Khan S, Kislinger T. Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: applications to cancer research[J]. Clinical Proteomics, 2020, 17: 1-25.
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