拯救贝多芬，预防遗传性耳聋

拯救贝多芬，预防遗传性耳聋。哈佛医学院和波士顿儿童医院的科学家已经使用一种新颖的基因编辑方法来挽救患有遗传性听力损失的小鼠的听力，并且成功地做到了这一点，而没有任何明显的脱靶效应。

这些动物-被称为贝多芬小鼠-经过相同的基因突变治疗，导致人类渐进性听力丧失，最终在20多岁时严重耳聋。

该新方法于7月3日在线发表在《自然医学》（Nature Medicine）上，其中涉及经典CRISPR-Cas9基因编辑系统的优化，更精确版本，该系统可以更好地识别在贝多芬小鼠中发现的致病突变。经过改进的工具使科学家能够选择性地禁用称为Tmc1的听力基因的缺陷拷贝，同时保留健康拷贝。

拯救贝多芬，预防遗传性耳聋

研究人员报告说，值得注意的是，他们的系统设法从小鼠基因组的30亿个碱基中识别出缺陷拷贝中的单个不正确的DNA碱基。

研究人员警告说，在像这样的高度精确的基因编辑疗法可以用于人类之前，还有许多工作要做。但是，他们说，这项工作是一个里程碑，因为它大大提高了标准基因编辑技术的功效和安全性。

“我们的结果表明，如今经典的CRISPR / Cas9编辑工具的这种更精细，更有针对性的版本实现了前所未有的鉴定和准确性，”研究合作资深研究员大卫·科里（David Corey）说道。哈佛医学院布拉瓦尼克学院。

此外，研究小组说，研究结果为使用相同的精密方法治疗由单一缺陷基因拷贝引起的其他显性遗传疾病奠定了基础。

研究背景

每个人都继承同一个基因的两个副本-每个父母都有一个副本。在许多情况下，一个正常基因足以确保正常功能，使个人免于疾病。相比之下，在所谓的显性遗传疾病中，单个有缺陷的副本会导致疾病。

哈佛大学医学院耳鼻咽喉和神经病学教授杰弗里·霍尔特（Jeffrey Holt）表示：“我们相信我们的工作打开了通往针对性强的方法的大门，该方法可以治疗由一个基因的一个缺陷拷贝引起的一系列遗传疾病。”波士顿儿童医院也隶属于FM波士顿儿童基金会的柯比神经生物学中心。 “这确实是精密医学。”

携带有缺陷Tmc1基因的小鼠被称为贝多芬小鼠，因为它们的病程模仿着名作曲家所经历的进行性听力丧失。然而，路德维希·范·贝多芬失聪的原因仍然是一个推测的问题。

在小鼠中，贝多芬缺陷在Tmc1基因的DNA序列中以一个不正确的字母标记-一个A而不是一个T-单个错误拼写了正常听力和耳聋之间的差异。

禁用或沉默Tmc1基因的突变体拷贝足以保护动物的听力，但是如何在不无意中破坏健康基因的情况下完成呢？

两把钥匙胜过一把

经典CRISPR-Cas9基因编辑系统通过使用指导分子gRNA来识别目标突变体DNA序列。一旦目标DNA被精确定位，切割酶Cas9就将其剪断。

到目前为止，这些基因编辑器的准确性还不尽人意。这是因为将Cas9酶引导至目标位点的引导RNA和切割目标DNA的Cas9酶并不完全精确，最终可能会切割错误的DNA。

为了避免这些挑战，研究人员采用了最初由HMS病理学教授Keith Joung和HMS病理学助理教授Ben Kleinstiver开发的工具，该工具使用源自金黄色葡萄球菌的改良Cas9酶代替标准Cas9。来源于化脓性链球菌。

为了提高检测和破坏的准确性，新的优化系统结合了两个识别级别-gRNA定位目标基因和经过修饰的Cas9形式，可以查明贝多芬小鼠中的特定DNA突变。两种形式的鉴定可确保准确，选择性地切割该基因的异常拷贝-仅剪切异常拷贝。

研究第一作者本斯·吉尔基（Bence Gyorgy）说：“我们利用了该系统识别突变体DNA但不能识别正常DNA的事实，并使用双重识别系统来提高精确度。”瑞士巴塞尔的分子与临床眼科。 “这种方法导致了针对突变基因的前所未有的特异性水平。”

在有或没有贝多芬突变的细胞中进行的最初一组实验中，该工具可准确区分Tmc1基因拷贝中的突变DNA和正常DNA。进一步的分析表明，在包含一个缺陷基因和一个正常基因拷贝的贝多芬细胞中，至少有99％的分子“切割”仅发生在该基因缺陷拷贝中。

接下来，研究人员将这种基因编辑疗法注射入有或没有贝多芬突变的小鼠的内耳。 DNA分析表明，编辑活性仅在患有贝多芬缺陷的小鼠的内耳细胞中发生。在没有突变的被治疗小鼠的内耳细胞中未检测到编辑变化-这一发现证实了该工具的准确性。

为了确定基因编辑疗法是否干扰正常的基因功能，科学家从没有携带贝多芬缺陷的经过治疗的小鼠的内耳中刺激出了被称为毛细胞的听力细胞。细胞显示出不变的正常听觉反应，证实了基因编辑疗法对正常基因功能没有影响。

沉默贝多芬

为了衡量这种疗法是否对动物有效，而不仅仅是对细胞有效，研究人员进行了金标准的听力测试。他们测量了动物的听觉脑干反应，该反应捕获了内耳毛细胞检测到多少声音并将其传输到大脑。

未经治疗，贝多芬小鼠通常在6个月大时就完全失聪。相比之下，没有遗传缺陷的小鼠在整个生命中都能保持正常的听力，并且可以检测到大约30分贝的声音-类似于耳语的水平。

在接受基因编辑治疗两个月后，贝多芬小鼠的听力明显好于携带基因突变的未处理兄弟姐妹。经过处理的动物能够检测到大约45分贝的声音-正常对话的水平-或比未经处理的小鼠安静16倍。保留最多听力的贝多芬小鼠能够听到25至30分贝的声音，这与健康同龄人几乎没有区别。

综上所述，这些发现表明，新的基因疗法有效地沉默了该基因的缺陷拷贝，并挽救了动物在疾病中常见的快速消亡的听力。

由于该疾病以渐进性听力下降为特征，因此研究人员评估了该疗法对几个月发展的影响。研究人员在出生后不久就进行了治疗，并每四个星期测试有无突变的经治疗和未经治疗的小鼠的听力水平，长达六个月。在第一个月中，未经治疗的贝多芬小鼠可以听到低频声音，但在高频下有明显的听力损失。出生后六个月，未经治疗的贝多芬小鼠失去了全部听力。相反，经过治疗的贝多芬小鼠在低频下仍保持接近正常的听力，有些甚至在高频下也表现出接近正常的听力。

值得注意的是，没有携带遗传缺陷的被治疗动物由于基因治疗而没有任何听力损失。这一发现证明了该程序的安全性以及选择性靶向基因异常拷贝的能力。更令人鼓舞的是，跟踪治疗近一年的一小部分经过治疗的贝多芬小鼠保持稳定，接近正常的听力。

由于贝多芬缺陷的特征是内耳听力细胞的逐渐退化和死亡，因此研究人员使用电子显微镜观察了这些关键听力细胞的结构。正如预期的那样，在未经治疗的贝多芬小鼠中，研究人员看到了听力细胞的逐渐丧失以及其结构的恶化。相比之下，经治疗的贝多芬小鼠和经治疗的健康小鼠均保留了正常数目的具有完整或接近完整结构的听力细胞。

在最后的实验中，科学家们在一系列带有贝多芬突变的人类细胞中测试了这种疗法的效果。 DNA分析显示，这种治疗仅在Tmc1基因的突变拷贝中引起编辑，而没有保留正常的突变。

由于它具有靶向单点遗传突变的能力，该方法有望解决其他15种形式的遗传性耳聋，这些遗传性耳聋也是由其他听力基因的DNA序列中的单字母突变引起的。

此外，研究小组说，他们的技术可能适用于由单点突变引起的其他显性遗传疾病。为了确定其假说效用，科学家们扫描了联邦ClinVar数据库，该数据库是与人类疾病相关的所有已知基因突变的国家资料库。分析表明，基于该工具的特异性，它可以正确地识别3759个缺陷基因变异，这些变异共同导致了人类主要遗传突变的五分之一。

霍尔特说：“拯救贝多芬，预防遗传性耳聋。可以肯定的是，这是漫长旅程的第一步。” “但是我们在这里得到的原理证明表明，可以开发出这种高度特异性，高度针对性的治疗方法，以选择性地沉默携带单点突变的基因，并可能治疗许多其他形式的人类疾病。”

引用

Harvard Medical School. "Saving Beethoven: Preventing hereditary deafness: Optimized gene-editing tool prevents hearing loss in mice with hereditary deafness without detectable off-target effects." ScienceDaily. ScienceDaily, 3 July 2019. www.sciencedaily.com/releases/2019/07/190703121434.htm.