JEM新成果揭示巨噬细胞在前列腺癌骨转移去势治疗耐药中的作用机制

2023年2月7日，爱丁堡大学医学院和复旦大学人类表型组研究院钱斌治团队在Journal of Experimental Medicine上发表论文 Macrophages promote anti-androgen resistance of prostate cancer bone disease。该研究首次发现巨噬细胞和前列腺癌去势治疗耐药之间的关联，并根据该机制发现了新的mCRPC治疗药物。

此项研究中scRNA-seq数据已存储于国家基因库生命大数据平台（CNGBdb），项目编号为：CNP0003856。

研究背景

前列腺癌是最常见的男性恶性肿瘤之一。去势疗法（androgen deprivation therapy）是其重要的治疗手段【1】。转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer, mCRPC）是前列腺癌发展的终末阶段，约90%前列腺癌死亡发生在该阶段【2, 3】。目前临床上常用的去势治疗药物恩杂鲁胺是雄激素受体抑制剂，能竞争抑制雄激素与受体的结合【8】。前列腺癌去势治疗耐药的机制有癌细胞内在的因素，例如Rb1、Trp53和Cdh1缺失，原癌基因fam110b的调控等【4-7】；然而转移瘤微环境对去势治疗耐药的外源调控目前仍知之甚少。

研究内容

首先，作者用多个前列腺癌病人转录组数据库分析发现，与原位癌或其他器官的转移灶相比，巨噬细胞在骨转移灶高度富集。并且巨噬细胞的数量越高，接受抗雄激素治疗的前列腺癌骨转移患者的总体生存期越低。为探索巨噬细胞的影响，作者利用MycCaP小鼠前列腺癌细胞构建了一个全新的激素依赖的前列腺癌骨转移体内模型，首次完整地模拟了转移性前列腺癌患者由去势治疗响应转变为治疗抵抗（naïve-responsive-resistant）的病程进展。和病人样品类似，该模型同样具有大量巨噬细胞浸润且其数量随治疗增加。利用该模型，作者发现用氯膦酸二钠脂质体（Clodronate liposome）清除巨噬细胞或用白喉毒素特异清除CD11b+F4/80+巨噬细胞（CD11b-DTR），均可显著提升耐药期的恩杂鲁胺的药效，从而证明巨噬细胞在前列腺癌骨转移治疗抵抗中发挥重要作用。

组织中的巨噬细胞源于两种不同谱系：由胚胎前体细胞分化而成的组织固有巨噬细胞（resident-tissue macrophages, RTM）和骨髓单核细胞来源的巨噬细胞（monocyte derived macrophages）。这两种巨噬细胞在肿瘤发展中可能发挥不同的作用，例如作者团队前期研究发现Ly-6C+炎性单核来源的巨噬细胞促进乳腺癌骨转移，而CD169+RTM没有促转移作用【9】。为探究前列腺癌骨转移灶浸润免疫细胞的组成，作者对小鼠模型的不同肿瘤发展阶段（healthy-naïve-responsive-resistant）的骨组织巨噬细胞进行单细胞转录组测序，发现Isg15+巨噬细胞和炎性单核细胞（Inflammatory monocytes）随着耐药进程数量显著增加，而伪时序分析表明Isg15+巨噬细胞可能由炎性单核细胞分化而来，这表明炎性单核细胞来源的巨噬细胞可能在去势治疗抵抗中发挥重要作用。CCR2是介导炎性单核细胞募集的主要受体，而CD169是骨髓RTM的标志分子【10-12】。为了更加直接探究导致去势治疗抵抗的巨噬细胞谱系，作者用Ccr2-/-和Cd169-DTR小鼠，分别构建了单核细胞招募缺陷和骨髓RTM特异清除的小鼠模型。结果显示单核细胞来源的巨噬细胞在骨转移癌生长和耐药中皆具有重要的促进作用。而骨髓RTM不促进骨转移本身，却能显著促进转移癌的去势治疗抵抗。这一功能转换揭示了一种巨噬细胞促进肿瘤的全新模式。

为了进一步探索其中机制，作者分别用流式分选出未治疗对照组（Naïve）、耐药组（Resist）和耐药发生后巨噬细胞清除组（Resist-Mac）的小鼠骨转移灶中的前列腺癌细胞进行转录组测序（bulk RNA-seq），发现有394个基因在耐药时上调（Resist vs Naïve）并在巨噬细胞清除时下调（Resist-Mac vs Resist），这些基因最可能与巨噬细胞导致的恩杂鲁胺耐药有关。富集分析表明这些基因最可能参与的通路包括细胞外基质-受体通路（ECM-receptor interation pathway）和粘着斑通路（Focal adhesion pathway）。比起原位癌或其他器官转移灶，ECM-receptor通路基因在接受抗雄激素治疗的患者的骨转移灶中有更高的表达，这些数据表明该通路很可能参与调控前列腺癌骨转移耐药。作者从中筛选出表达量与巨噬细胞数量呈正相关的纤维粘连蛋白（Fribronectin，FN1）及其受体整合素α5（Integrin alpha 5, ITGA5）进行进一步实验。作者构建FN1敲降的肿瘤模型，发现恩杂鲁胺耐药受到明显抑制；然而用Cas9-VP64过表达系统构建ITGA5过表达肿瘤模型，耐药明显增强。这表明FN1-ITGA5这一对ECM-receptor通路促进恩杂鲁胺耐药。而研究表明Focal adhesion pathway主要激活酪氨酸激酶Src，并且Src可能参与前列腺癌的去势治疗抵抗【13-16】，所以作者猜测FN1-ITGA5可能调控Focal adhesion通路从而调控Src活性。随后，作者发现敲降或过表达FN-1和ITGA5会分别造成Src活性的下降或上升。通过一个作者研发的全新的Src抑制剂eCF506，进一步证实了Src活性的抑制能显著抑制骨转移瘤的耐药性生长。这些数据表明前列腺癌骨转移细胞的FN1-ITGA5-SRC信号通路促进了恩杂鲁胺耐药。

那么，巨噬细胞是如何调控前列腺癌细胞的这一信号通路的呢？作者通过RNAseq确定了巨噬细胞高表达的耐药相关（Resist vs Naïve）的候选细胞因子，再从中筛选出了在病人数据中与FN1-ITGA5表达量及巨噬细胞数量呈正相关的一个细胞因子：Activin-A。作者发现用含有Actvin-A的培养基培养前列腺癌细胞或构建高表达Actvin-A的肿瘤模型，均能显著促进FN1-ITGA5的表达并促进耐药；而Activin A受体敲降（shAcvr1b或shAcvr2a）的肿瘤模型则对恩杂鲁胺有更高敏感性。这些数据表明，巨噬细胞分泌Activin A调控前列腺癌细胞的FN1-ITGA5-SRC信号通路，从而促进耐药。

研究结论

综上所述，这项研究发现巨噬细胞在高致死率的转移性前列腺癌去势治疗抵抗中的重要作用，并揭示新的耐药机制：巨噬细胞分泌Activin-A激活前列腺癌细胞FN1-ITG5-SRC信号通路，最终导致去势治疗抵抗。该研究还发现Src抑制剂eCF506能有效治疗mCRPC，为临床上治疗前列腺癌骨转移提供新的治疗手段。

爱丁堡大学医学院、复旦大学人类表型组研究院钱斌治教授和纪念斯隆－凯特琳癌症中心Charles Sawyers教授为该研究共同通讯作者。钱斌治团队的博士后李雪峰和Cigdem Selli为该研究共同第一作者。钱斌治团队的曹健博士、吴水清博士、周翰林博士、马若愚博士、张承斌、林晞晨、荀碧洁作为共同作者对该研究做出了重要贡献。华大生命科学研究院的李贵波博士团队、上海第六人民医院肿瘤内科的胡海燕主任及浙江大学医学院附属第二医院的孙凌凌博士对本研究提供了大量帮助。

原文链接：https://doi.org/10.1084/jem.20221007
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