Nature子刊 | Leukemia发表CAR-T细胞功能失调的单细胞染色质可及性图谱

2022年8月，浙江大学医学院/良渚实验室钱鹏旭、黄河团队在Leukemia上发表了题为Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction的研究论文【7】。该研究利用scATAC-seq技术在单细胞水平描绘了在体外培养和多发性骨髓瘤病人体内的CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞过程中的染色质可及性动态变化。研究发现，无论是在体外模型或者体内环境下，转录因子BATF和IRF4都会特异的在终末耗竭CAR-T细胞中激活，而且抑制BATF和IRF4的表达可以有效增强CAR-T细胞的存活、提高抗肿瘤活性。

此项研究使用的scATAC-seq数据已存储于国家基因库生命大数据平台（CNGBdb），项目编号为：CNP0002442。

研究背景

嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）T细胞免疫治疗，是第一种被美国FDA批准的细胞治疗药物，在多种恶性血液肿瘤中都取得了良好的治疗效果【1】。虽然CART治疗取得了巨大的成绩，但是也存在着一些弊端和不良反应，包括体内持久性差、易复发、不能有效扩增、靶抗原丢失或突变、细胞因子综合征和神经系统毒性、有限的适用性等【2】。在慢性感染和肿瘤中，持续性的抗原刺激会导致T细胞分化出一些低杀伤或无杀伤能力的T细胞亚群，这群T细胞被称为耗竭型（exhausted）T细胞。高抗原压力导致CAR信号过度激活以及CAR受体聚集而产生的抗原非依赖的Tonic信号通路活化也会导致CART细胞出现耗竭。耗竭状态的CART细胞增殖变慢、细胞因子释放减少、凋亡率提高，同时也伴随着PD-1、LAG-3、CTLA-4等免疫抑制性受体的高表达【3, 4】。在临床肿瘤治疗中，CART细胞耗竭是一种影响细胞增殖和体内维持的重要因素，这也是导致肿瘤杀伤效果差和肿瘤复发的重要原因【3】。因此，减缓CART细胞耗竭速度、延长初始（naive）T细胞和记忆（memory）T细胞在体内的维持时间，将有助于提高CART疗法的治疗效果。

表观遗传调控在CART细胞分化、耗竭中起到极为重要的作用。近几年，有研究者已经利用流式分选加bulk ATAC-seq的方法对多种耗竭模型CAR-T细胞分化过程中的染色质可及性动态变化进行了检测，并以此筛选和鉴定出耗竭CAR-T细胞中显著富集的一些关键耗竭相关转录因子，包括NR4A、TOX、JUN等【4-6】。通过调控这些基因在CAR-T细胞中的表达可以显著增强CAR-T细胞的治疗效果。虽然CAR-T细胞耗竭相关机制研究已经取得了一些进展，但是这些基于bulk ATAC-seq的研究并不能很好的揭示细胞间的异质性。因此探索在肿瘤抗原刺激过程中，CAR-T细胞在单细胞水平的染色质可及性动态变化对于揭示CAR-T细胞功能失调、耗竭的相关机制具有重要意义。

研究内容

首先，作者利用体外杀伤模型探索CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞过程中的细胞分化、耗竭等变化。结果显示CAR-T细胞在接触肿瘤细胞后会迅速由初始T和中央记忆T向效应记忆T和效应T细胞分化，并且伴随着免疫抑制受体PD-1、LAG-3、TIM-3表达水平的显著升高，提示CAR-T细胞出现耗竭。

为了探索表观遗传调控在CAR-T细胞分化、耗竭过程中的调控机制，作者利用scATAC-seq检测了CAR-T细胞在肿瘤抗原刺激过程中的染色质可及性动态变化，并根据耗竭相关受体的染色质可及性差异，定义了两个耗竭细胞亚群：中间耗竭T细胞和终末耗竭T细胞。为了验证体外杀伤模型中确实存在着相对耗竭的细胞亚群，作者将受到过肿瘤抗原刺激的CAR-T细胞分为LAG-3+和LAG-3-两组并再次接受肿瘤细胞抗原刺激。结果显示LAG-3+对肿瘤细胞的杀伤能力显著降低，且会表达更高的PD-1、TIM-3等免疫抑制受体。利用染色质可及性差异，作者构建了CAR-T细胞从初始T细胞、效应T细胞、中间耗竭T细胞、终末耗竭T细胞的发育轨迹。另外作者发现中间耗竭T细胞特异升高的染色质可及区域中显著富集了JUN、FOS、NFKB1、BACH2等转录因子的motif，而在终末耗竭T细胞中显著富集了BATF、IRF4、PRDM1等转录因子的motif。为了探索CAR-T细胞在病人体内杀伤肿瘤细胞的过程中是否也具有和体外类似的染色质可及性变化及转录调控模式，作者分别在CAR-T细胞扩增高峰期（10-13天）和衰退阶段（29-33天）收集多发性骨髓瘤病人的CAR-T细胞样本进行scATAC-seq实验。结果同样可以找到一群相对耗竭的CAR-T细胞，而且其中富集的转录因子也包含JUN、FOS、JUNB、BATF、IRF4、PRDM1等。考虑到BATF和IRF4在终末耗竭中会出现特异激活，并且TOX、CTLA4等关键耗竭相关基因座附近的差异染色质可及性区域中存在BATF和IRF4的motif，所以BATF和IRF4可能特异的在终末耗竭CAR-T细胞中发挥重要作用。

为了进一步验证BATF和IRF4对于CAR-T细胞耗竭的影响，作者分别构建了敲降BATF和IRF4的CAR-T细胞模型，然后利用体外杀伤实验和小鼠白血病模型来验证猜想。结果显示，BATF和IRF4敲降后都可以显著降低CAR-T细胞中PD-1、TIM-3等免疫抑制受体的表达，增加初始T和中央记忆T细胞的比例，增强CAR-T细胞的对白血病细胞的杀伤效果、延长CAR-T细胞在小鼠体内的维持时间。

研究结论

综上所述，该研究在单细胞水平描绘了CART细胞杀伤、耗竭过程中的染色质可及性动态变化图谱，完善了CART细胞耗竭的表观遗传调控机制，为研究者探索CAR-T细胞的表观遗传特征提供了重要的数据资源。另外对体内、外CAR-T细胞耗竭相关转录因子的探索，也为临床改造CART细胞以实现更好的治疗效果提供新的思路。

浙江大学基础医学院/良渚实验室钱鹏旭研究员、浙江大学医学院附属第一医院/良渚实验室黄河教授为本文的共同通讯作者。博士后姜蓬垒、博士研究生张召茹、浙江大学医学院附属第一医院胡永仙主任、博士研究生梁祖宇为本文共同第一作者。

参考文献： 、 1. June CH, Sadelain M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. The New England journal of medicine 2018 Jul 5; 379(1): 64-73.
2. Shah NN, Fry TJ. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nature reviews Clinical oncology 2019 Jun; 16(6): 372-385.
3. Long AH, Haso WM, Shern JF, Wanhainen KM, Murgai M, Ingaramo M, et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat Med 2015 Jun; 21(6): 581-590.
4. Lynn RC, Weber EW, Sotillo E, Gennert D, Xu P, Good Z, et al. c-Jun overexpression in CAR T cells induces exhaustion resistance. Nature 2019 Dec; 576(7786): 293-300.
5. Chen J, Lopez-Moyado IF, Seo H, Lio CJ, Hempleman LJ, Sekiya T, et al. NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solid tumours. Nature 2019 Mar; 567(7749): 530-534.
6. Seo H, Chen J, González-Avalos E, Samaniego-Castruita D, Das A, Wang YH, et al. TOX and TOX2 transcription factors cooperate with NR4A transcription factors to impose CD8(+) T cell exhaustion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2019 Jun 18; 116(25): 12410-12415.
7. Jiang P, Zhang Z, Hu Y, Liang Z, Han Y, Li X, et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia 2022 Aug 12.
8. Jiang, P., Zhang, Z., Hu, Y. et al. Single-cell ATAC-seq maps the comprehensive and dynamic chromatin accessibility landscape of CAR-T cell dysfunction. Leukemia (2022).
信息来源：“BioArtMED”公众号