NC发表首个家猪单细胞转录图谱，揭示内皮细胞异质性与小胶质细胞转录调控机制

2022年6月24日，深圳华大生命科学研究院Lars Bolund再生医学研究所罗永伦教授，联合丹麦奥胡斯大学林琳教授等多家国内外科研团队合作在Nature Communications上发表了题为“Endothelial cell heterogeneity and microglia regulons revealed by a pig cell landscape at single-cell level”的研究。该研究基于单细胞转录组测序构建首次家猪多个组织和器官的单细胞转录组图谱，并揭示了血管内皮细胞在组织器官内的功能抑制性和大脑小胶质细胞遗传保留转录调控网络，对促进模式猪在异种器官移植和生物医药领域的应用提供关键科研资源和科学基础。

本研究中产生的单细胞测序数据已存储于国家基因库生命大数据平台（CNGBdb），项目编号为：CNP0002165。

家猪（Sus scrofa domesticus）是生物医药研究、新药开发、研究人类复杂疾病机理的的关键模式大动物之一。由于猪器官在大小、结构、生理功能、和遗传学等方面都与人类器官非常接近，也是被公认为解决器官紧缺医学问题的最佳异种器官移植供体[1,2]。通过基因编辑和克隆技术，疾病模型猪已经被成功应用于杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy）、亨廷顿病（Huntington’s disease）、糖尿病（Diabetes）等[3-5]。今年初，首例将基因编辑猪的心脏成功移植到绝症患者体内试验也在美国马里兰大学医学院成功进行。由于目前缺乏对猪组织器官细胞异质性和基因表达调控了解，疾病模型猪的表型和异种器官移植的临床表现依然有待改进[6, 7]。因此，深入认识并阐明家猪组织器官细胞异质性和基因表达调控机制是促进模式猪在生物医药领域的应用和异种器官移植的重要手段。

主要研究结果

目前，多个模式动物的单细胞转录图谱陆续被完成，为填补了家猪在这一研究领域的空白，该研究结合细胞核转录组（snRNA-seq）和单细胞转录组（scRNA-seq）两种高通量细胞转录组分析技术技术，获得了20个组织器官中222,526细胞的高质量单细胞转录组数据（图1a-d）。结合单细胞转录组聚类分析，降维可视化（tSNE），和基因功能富集分析，该研究鉴定了234种表达特异性细胞聚类和58种细胞类型特异表达基因（图1e-f），并进一步构建了可视化家猪单细胞转录组数据库（Pig Single Cell Atlas Database）[8]。

血管内皮细胞在组织器官中具有高度异质性，并且与异种器官移植的免疫排斥反应密切相关。但目前对家猪血管内皮细胞异质性的研究几乎为零，因此作者结合前期对小鼠和人内皮细胞异质性研究的基础[9-10]，通过细胞类型特异性表达基因筛选方法，鉴定21种具有特异表达特征和功能的血管内皮细胞类型，其中包括增殖内皮细胞和激活型免疫调控内皮细胞（图2a-c）。由于该研究在分析脂肪组织细胞过程中，采用有利于富集内皮细胞的分离方法，该研究团队对脂肪内皮细胞进行了更加深入的研究，并通过并通过拟时序分析（pseudotime analysis），免疫荧光染色，和定向诱导分化实验发现和验证了依赖于TGF-b2信号通路的内皮间质转分化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）细胞类型（图2d-f）。这些数据表明：在家猪组织和器官中，内皮细胞也存在着高度的功能异质性，为进一步利用模式猪研究人类心血管疾病和改善异种器官移植免疫排斥反应提供关键基础数据。

同小型模式动物相比，猪大脑结构与人类更加接近，因此也是被认为研究人类大脑和退行性神经疾病的重要大动物模型。小胶质细胞（microglia）是中枢神经系统中的组织驻留免疫细胞，在哺乳动物的大脑中可以进行自我更新，是中枢神经系统中反应最快、也是最主要的免疫屏障。作者以小胶质细胞作为研究对象，对家猪、人、小鼠、蜥蜴等13个物种的大脑小胶质细胞单细胞转录组数据，利用基因调控网络推断（GENIE3）方法系统研究小胶质细胞在进化过程中的转录因子调控网络（图3a-e）。作者发现MEF2C等核心转录因子以及其调控基因在小胶质细胞的演化中具有保守性（图3f-g）。虽然该研究没有对这些核心转录调控网络的作用机制和其它大脑细胞类型进一步深入研究，针对小胶质细胞转录调控网络分析表明：MEF2C转录调控可能小胶质细胞分子遗传进化过程中起到非常关键的作用。

结论

综上所述，该研究基于单细胞转录组测序首次构建家猪多组织和器官的细胞图谱，首次通过单细胞转录组分析方法证明血管内皮细胞在家猪组织器官中的异质性，并结合多种生物信息分析手段和实验方法发现和验证了脂肪组织中存在内皮间质转分化细胞亚型（EndMT），以及证明TGF-b2信号通路在EndMT中的关键作用，对进一步利用模式猪研究血管疾病和解决异种器官移植免疫排斥提供新资源。此外，该研究从另外一个角度展示了家猪单细胞转录组图谱的应用价值。通过系统比较和分析13个物种大脑小胶质细胞单细胞转录数据，该研究提出MEF2C转录调控网络可能在小胶质细胞分子遗传进化过程起到非常关键作用的假设，并需后续研究进一步证明。

深圳华大生命科学研究院Lars研究所和奥胡斯大学王飞博士、中国科学院大学硕士研究生丁佩文、青欧与哥本哈根大学联合培养博士生梁雪、奥胡斯大学博士生丁香凝，和奥胡斯大学博士生Camilla B. Brandt为该论文共同第一作者。

参考文献：
[1] Wolf, E., Kemter, E., Klymiuk, N. & Reichart, B. Genetically modified pigs as donors of cells, tissues, and organs for xenotransplantation. Anim. Front. 9, 13-20 (2019).
[2] Sykes, M. & Sachs, D.H. Transplanting organs from pigs to humans. Sci. Immunol. 4, eaau6298 (2019).
[3] Klymiuk N, Blutke A, Graf A, Krause S, Burkhardt K, Wuensch A, et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Human Mol Genet. 2013;22:4368-82.
[4] Yan, S. et al. A huntingtin knockin pig model recapitulates features of selective neurodegeneration in Huntington’s disease. Cell 173, 989-1002 e1013 (2018).
[5] Kleinwort, K. J. H. et al. Retinopathy with central oedema in an INS (C94Y) transgenic pig model of long-term diabetes. Diabetologia 60, 1541-1549 (2017).
[6] Montgomery RA, Stern JM, Lonze BE, et al. Results of Two Cases of Pig-to-Human Kidney Xenotransplantation. N Engl J Med. 2022;386(20):1889-1898. doi:10.1056/NEJMoa2120238.
[7] Griffith BP, Goerlich CE, Singh AK, et al. Genetically Modified Porcine-to-Human Cardiac Xenotransplantation [published online ahead of print, 2022 Jun 22]. N Engl J Med. 2022;10.1056/NEJMoa2201422. doi:10.1056/NEJMoa2201422
[8] Pig Single Cell Atlas Database. URL:https://dreamapp.biomed.au.dk/pigatlas/
[9] Kalucka J, de Rooij LPMH, Goveia J, et al. Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells. Cell. 2020;180(4):764-779.e20. doi:10.1016/j.cell.2020.01.015.
[10] Goveia J, Rohlenova K, Taverna F, et al. An Integrated Gene Expression Landscape Profiling Approach to Identify Lung Tumor Endothelial Cell Heterogeneity and Angiogenic Candidates [published correction appears in Cancer Cell. 2020 Mar 16;37(3):421]. Cancer Cell. 2020;37(1):21-36.e13. doi:10.1016/j.ccell.2019.12.001.