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<第八期课程回顾>PCR 入门之基础篇—追根溯源

2019-10-18 481课程PCR

课程回放:

https://vzan.com/live/tvchat-166888644?v=0.6102865672877946

CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦!
2019年10月17日<第八讲>上线
课程名称:PCR 入门之基础篇—追根溯源

讲师:徐怀前,华大股份科技服务业务定制化项目负责人。负责科技服务业务的微量DNA/外显子、TBS、RRBS、Medip、ATAC-seq、Hi-C、HMST、10xgenomics、cirRNA、RIP-seq、微量转录组、免疫组库、流式细胞分选等业务,具备丰富的高通量建库相关经验。

课程概要

PCR技术起源:

  1. 分离出耐高温Taq DNA聚合酶(1973年钱嘉韵)
  2. 发明PCR(1983年Mullis)
  3. Taq DNA聚合酶应用于PCR(Saiki)

PCR各成份主要作用及影响(关注要点)

  1. 引物设计(长度、GC含量、引物二聚体、5'和3'端碱基、引物溶解和保存)
  2. dNTPs(浓度、储存液PH、储存温度)
  3. 二价阳离子(Mg2+>Mn2+,Ca2+无效、浓度)
  4. PCR缓冲液(PH、浓度)
  5. 反应促进剂
  6. DNA模板(GC含量、结构、模板量)
  7. DNA聚合酶(热稳定DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶)

现场Q&A

  1. Q:如何避免PCR循环产生的错误率?
    A:1) 在PCR产量满足下游实验的情况下,PCR循环数越低越好;2) 使用高保真PCR聚合酶。

  2. Q:肝素是如何影响PCR反应的?
    A:血液提取后,肝素容易和DNA紧密结合在一起,很难被清除掉,会导致pcr反应效率低或失败。

  3. Q:甲基化转化后产物扩增引物设计需要注意什么?
    A:尽量避免在甲基化的C区域设计引物,尤其是在3’端的时候,尽量选择A、T、G含量比较多的区域设计引物。

  4. Q:建库过程中哪一步异常会造成最后文库的GC含量比正常高2%个点,是否有可能是PCR的步骤中引入?
    A:只要是生物学实验都存在bias,只是bias的大小不同,不论是末端修复还是加接头,都有偏好性,但是我认为这些都不是关键,我个人认为影响GC含量的关键是PCR酶的选择。

  5. Q:引物设计的关键有哪些?
    A:可参考我们PPT上引物设计的几个关键点,具体引物设计需要根据具体情况做调整。

  6. Q:退火温度比Tm值低,为什么?
    A:退火温度比Tm值低5~10度左右,这是一个经验参数,此时引物退火效率比较高,并且不会导致太多非特异性结合。

课程PPT:

https://db.cngb.org/dc_assets/media/science/weike20191017.pdf

审核:徐怀前 图片来源:微课页面截图。

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