<2019第八期课程回顾>PCR 入门之基础篇—追根溯源

课程回放：

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CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦!
2019年10月17日<第八讲>上线
课程名称：PCR 入门之基础篇—追根溯源

讲师：徐怀前，华大股份科技服务业务定制化项目负责人。负责科技服务业务的微量DNA/外显子、TBS、RRBS、Medip、ATAC-seq、Hi-C、HMST、10xgenomics、cirRNA、RIP-seq、微量转录组、免疫组库、流式细胞分选等业务，具备丰富的高通量建库相关经验。

课程概要

PCR技术起源：

1. 分离出耐高温Taq DNA聚合酶（1973年钱嘉韵）
2. 发明PCR(1983年Mullis)
3. Taq DNA聚合酶应用于PCR（Saiki）

PCR各成份主要作用及影响（关注要点）

1. 引物设计（长度、GC含量、引物二聚体、5'和3'端碱基、引物溶解和保存）
2. dNTPs（浓度、储存液PH、储存温度）
3. 二价阳离子（Mg2+＞Mn2+，Ca2+无效、浓度）
4. PCR缓冲液（PH、浓度）
5. 反应促进剂
6. DNA模板（GC含量、结构、模板量）
7. DNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶）

现场Q&A

1. Q：如何避免PCR循环产生的错误率？
   A：1） 在PCR产量满足下游实验的情况下，PCR循环数越低越好；2） 使用高保真PCR聚合酶。

2. Q：肝素是如何影响PCR反应的？
   A：血液提取后，肝素容易和DNA紧密结合在一起，很难被清除掉，会导致pcr反应效率低或失败。

3. Q：甲基化转化后产物扩增引物设计需要注意什么？
   A：尽量避免在甲基化的C区域设计引物，尤其是在3’端的时候，尽量选择A、T、G含量比较多的区域设计引物。

4. Q：建库过程中哪一步异常会造成最后文库的GC含量比正常高2%个点，是否有可能是PCR的步骤中引入？
   A：只要是生物学实验都存在bias，只是bias的大小不同，不论是末端修复还是加接头，都有偏好性，但是我认为这些都不是关键，我个人认为影响GC含量的关键是PCR酶的选择。

5. Q：引物设计的关键有哪些？
   A：可参考我们PPT上引物设计的几个关键点，具体引物设计需要根据具体情况做调整。

6. Q：退火温度比Tm值低，为什么？
   A：退火温度比Tm值低5~10度左右，这是一个经验参数，此时引物退火效率比较高，并且不会导致太多非特异性结合。

审核：徐怀前 图片来源：微课页面截图。