<2019第五期课程回顾>如何利用NGS技术做遗传病基因组分析与研究

课程回放：

CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦!
2019年8月8日<第五讲>上线
课程名称：如何利用NGS技术做遗传病基因组分析与研究

讲师：方明艳/深圳华大生命科学研究院资深信息分析工程师，华大基因学院高级讲师，瑞典卡罗林斯卡医学院医学科学博士。

课程概要

1. 高通量测序实验、分析流程简介
2. 候选基因分析思路
3. 遗传病案例分析

现场Q&A

1. Q：转录组水平检测突变是否可靠？
   A：转录组水平的流程和基因组水平类似，也是variants calling （获得vcf文件），然后看突变数据的具体信息。比如说突变的质量信息及reads的支持情况；
   如何结合基因组水平和转录组水平分析，以遗传病为例，可以根据基因组突变的具体情况去判断，如果这个基因突变是loss-of-function，可以去转录水平找表达的表达情况，如果表达量有显著降低，也就反应了基因的功能。

2. Q：请问RAPID是什么？
   A：这是一个日本科学家建立的原发性免疫缺陷病的数据库，在2012年之后就没有更新，之前都是手动收集和致病相关的突变信息，所以这个数据库质量比较高，但是因为后续没有更新，所以其数据量始终维持在6000个左右。
   补充信息：http://web16.kazusa.or.jp/rapid_original/

3. Q： 没有检测到变异的区域是否也可能是很重要的区域？
   A：首先看参考基因组区域是否是N，如果不是N的话，需要判断这个区域的特征，比如是否存在重复序列或GC含量异常，举例的数据是基于WES的分析结果，如果通过以上判断，捕获环节也没有问题，或基于WGS的分析时，这个就是重要的区域，即完全没有变异但是被检测到。

4. Q： 基于染色体区域变异情况，这个是从哪里可以看到呢？
   A：这个是需要统计的数据，一般这个不是常规分析过程中改的，不过做生物信息分析时，比对文件中有一个bam_stat文件(bwa比对)，或者用Soap比对也有一个SOUP_stat文件，这些文件可以看出具体基因每一个外显子coverage的情况，还有探针的覆盖情况以及实际的覆盖情况，然后根据这些数据就可以做出这个图（PPT：21）。
   PPT22页的图是因为我们研究时比较关注这个基因，在做变异（拷贝数/结构）分析时发现它存在大段的缺失，但是这个是基于不同的样本，即每个样本是不同的颜色，这块区域在所有样本中都是缺失的，所以我们想研究这是什么原因导致的缺失，看是群体的差异还是参考基因组的差异，后来发现是由于参考基因组的N序列导致的。

5. Q： 老师有没有与畸形相关的数据库推荐？
   A：畸形相关数据库我这边没有做具体了解，但是遗传病相关的都可以看OMIM数据库，还有CNGBdb上的罕见病数据库也是可以做搜索的。

6. Q： non-coding区域目前有哪些疾病研究过？
   A：具体疾病名称我可能记得不是很清楚，但是我记得有一个在启动子区域大概1M的位点，是一个非常保守的位点，这个位点的突变导致了表达出现异常，这个是有被报道的；有些免疫缺陷也会发现大片断的缺失，即除了外显子区域之外还会出现内含子或者相邻区域的缺失，也会导致一些表型；神经肌肉类疾病，会有一些简单序列重复的次数不一致，也会导致一些变异，这些可能出现在coding区域也可能出现在non-coding区域。
   参考文献：Lettice LA et al, Hum Mol Genet, 2003

7. Q：好用的神经系统相关疾病 的数据库能否推荐几个？
   A：神经系统相关疾病很多，具体疾病来说都比较重要比如帕金森等，那么具体疾病都有其具体的数据库，但是用的相对多的，比较全面的就是我们CNGBdb上的罕见病数据库，其他的还有LOVD、Clinvar还有OMIM上都是有的。

8. Q：3D基因组可否有公用数据库可用？
   A：这个是有的，只是本次课程没有列举，比如TAD Boundaries found by ENCODE Hi-C experiments （https://www.encodeproject.org/matrix/?type=Experiment），可以直接下载。

9. Q：可否解释连锁分析？
   A：在用NGS之前很多关于遗传病的研究都是基于连锁分析，所谓连锁分析是基于不同的marker比如SNP、SSR等，通过比较患者和正常人之间的差异，就可以定位到一个宽泛的区域（有时候有几M区域） ，即基因比较多，筛选起来比较困难。

10. Q： 哪里可以看到测序数据的哪些染色体区域没有变异或未捕获到？
    A：如果做变异注释时用到的软件是VEP的话，VEP分析结果中有一个网页的报告文件，会展示染色体上突变的检测情况。也可以自己根据变异的情况画图展示。

11. Q： 同义突变有什么致病评分吗？
    A： 这个比较少，因为一般认为同义突变对氨基酸是没有改变的，所以正常情况下认为同义突变是不致病的；但是在合成生物学或基因治疗领域发现，同一密码子的表达效率是不同的，有时可能差几千倍，这样的情况下它也可能是致病的，就我所知目前没有软件可以预测同义突变的。

12. Q：非编码区域的位点如何筛选呢？
    A：可以根据一些软件，比如GWAWA，会有一些预测，但是非编码区的变异很多，即使筛选之后还是会留下很多位点，预测软件会有假阳性和假阴性率，所以预测软件的结果仅供参考，可以尝试筛选一下。当然有些重要区域，比如序列保守的区域、启动子区域、转录因子结合区域等都可以重点考虑。

13. Q：vcf的过滤参数如何设置？有文献推荐吗？
    A：需要看你的具体操作，对于原发性免疫缺陷，vcf文件我们会优先考虑对功能有害的突变、低频的突变，与功能相关的突变（在具体疾病组织中有表达）。

14. Q：同义突变是否还要考虑一下是否影响剪切之类的？
    A：这也是有可能的，除了同义突变，还有内含子区域的突变，即使突变位点没有靠近剪切位点的位置，但是它可能位于内含子保守区域的某个位点，它也有可能会影响剪切，这种情况下如果认为影响剪切，可以用PCR进行验证（产物长度）看是否影响剪切。

15. Q：如果疾病是复杂疾病，怎么筛选？
    A：复杂疾病需要用复杂疾病的研究策略，复杂疾病做的比较多的都是case/control的分析，需要样本量较大，例如1w对1w，可能现在这个数量级已经不够了，2010年左右的数量级已经是1w对1w，去判断在患者中一些突变频率较高的位点，一般要求p-value达到10-8。

16. Q：关于GDI分值的问题。
    A：GDI分值比较高，会出现high damage，即这个基因是high damage，那么它是不太重要的。GDI分值越高这个基因越不重要。筛选中可以先忽略GDI分值较高的基因。
    GDI分值高的基因即代表它们在绝大多数测序结果中都会被观测到，经常被报道可能在筛选后得到罕见、有害的变异，这些基因高频出现，所以其得分特别高。如果你研究的性状和这个基因相关性不高的情况下，这些基因可以先不考虑。

17. Q：通常在那个列表里面的基因多是由于哪些原因造成的呢？
    A：这个可能有几种不同的情况，比如TTN就是因为这个基因特别长，基因比较短的时候被检测到有害突变的概率是低于它比较长的时候，这是一个原因；还有一些原因，那些基因在进化中没有那么重要，比如嗅觉相关的基因；还有很多基因亚型和家族序列比较类似，有时候因为比对的原因导致的，比如HLA相关的基因，尤其是HG19我们只用到了一个HLA型别进行了比对，所以找到的HLA突变可能是其他型别的，实际上不是真正的突变；T细胞受体基因因为数量非常多，它可能反映的是多态性，而不是和疾病相关的突变。

课程作业 ：

https://db.cngb.org/dc_assets/media/science/Task_20190808.pptx

作业答案：
可能的候选基因为：
筛选过程：

1）  优先考虑非同义突变，剪切位点突变或者Indel；-------筛选AN列，挑选出非Low的突变（剩余62/239）；

2）  考虑频率低于1%突变， 公共数据库（结果中已完成这部分筛选），内部数据库-------筛选K列，参数为小于0.01（剩余60/239）；

3）  优先考虑非high damage gene------筛选AB列，参数为GDI-raw小于1000（剩余22/239）；

4）  除去低质量低reads 支持的位点（具体信息BS列标红），剩余10/239个为点；

5）  考虑家系情况：父母来自同一偏远上去，且非近亲结婚且均正常，亦无其他亲属患病报道。

考虑de novo突变导致，常染色体隐性遗传（复合杂合突变 or 纯合突变）or 双／多基因模式；   ------其中纯合突变是考虑父母来自同一偏远山区，有可能同时携带同一founder mutation。
1. 纯和突变仅一个基因ITK基因，其为stop-gain，SIFT score：0.14 （SIFT对stop gain的注释一般都有问题）；

a. CADD：36;  MSC:23.4  ----支持pathogenic；
b. 罕见变异，仅ExAC中有报道：0.000016541，gnomAD 中有报道：0.000007977 且无纯合突变报道----支持pathogenic；
c. ITK 报道为Lymphoproliferative syndrome 1, 613011的致病基因，已报道案例中也表现为早发（本案例1岁发病）且也是免疫系统障碍-----值得进一步开展验证工作。
2. 由于本示例中，仅测一个样本，所有的杂合突变都有可能为de novo突变，需要结合表型数据进一步家系内验证；
3. 但其他双基因遗传，比如PRKDC（NM_006904.6:c.9336-4dupT）和TYK2（NM_003331.4:c.2783C>T，NP_003322.3:p.Ala928Val） 也有可能，但值得注意的是这两个基因的GDI得分比较高。

审核：方明艳