热点综述 | 单细胞测序的扩展、整合与转化

近年来单细胞测序得到了飞跃式的发展，其横向上扩展到其他层面，如用于表观基因组分析的单细胞亚硫酸盐测序，纵向上扩展到多个组学数据整合和其他信息的整合，如空间转录组。近日，《Briefings in Functional Genomics》发表了一篇综述文章，系统地涵盖了单细胞测序中使用的技术和算法，并从横向和纵向两个维度上进行了扩展，还从助力癌症研究这一转化方向做了介绍。

单细胞转录组测序

scRNA-Seq是第一个建立的单细胞测序技术，已获得广泛的应用。2014-2015年期间，scRNA-Seq技术发展的突飞猛进促进了单细胞测序领域的发展。

scRNA序列由四个主要步骤组成，即单细胞分离、逆转录、cDNA扩增和文库构建：1）分离单个细胞有五种方法，即人工细胞选择、随机接种/稀释、激光显微切割、荧光激活细胞分选（FACS）和微流体/微板法，其中FACS是最常用的方法。2）逆转录和cDNA扩增可以使用三种方法进行：Tang’s method、体外转录：IVT（CEL-Seq和CEL-Seq2）、MMLV-TS（Smart-Seq、Smart-Seq2和STRT-Seq）。3）作为单细胞测序的一个独特步骤，单细胞被贴上一个独特的条形码，以汇集不同的样本而不致混淆，从而在同一测序通道上分析多个样本，这可以大大降低成本和后续工作量。具体来说，一个6-8个碱基对的条形码UMI被引入scRNA-Seq中，在逆转录过程中标记细胞内每个cDNA分子的身份。测序方法如CEL-Seq、CEL-Seq2、STRT-Seq和Drop-Seq都是基于UMI的。

单细胞数据分析中的一个主要挑战是，由于从单个细胞提取的RNA有限，在RNA扩增过程中，由于随机丢失事件，导致表达矩阵中出现大量零计数。这需要数据质量控制、标准化和降维的专业规范化。常用的数据处理方法包括Seurat、Monocle、Scanpy和Linnorm。

单细胞转录组测序的扩展

横向扩展

scRNA-Seq技术已迅速扩展到转录组以外的其他组学，包括基因组学、表观基因组学、蛋白质组学和代谢组学。

单细胞基因组可以通过批量测序，然后对感兴趣的突变或变异进行靶向单细胞DNA测序来实现，例如TARGET-Seq。计算工具Cardelino可以通过整合来自scRNA-seq的不常见变异等位基因和来自大量外显子序列的克隆树信息来区分克隆之间的表型变异，并识别两种状态之间的DEG。全基因组扩增是单细胞基因组分析的另一种方法，它包含三大类，即GenomePlex PCR、多重置换扩增（MDA）以及多重退火和基于滚环扩增放大的循环（MALBAC）。

单细胞表观基因组。表观遗传动力学和染色质状态也可以通过单细胞测序技术以单细胞分辨率捕获。实现这一点的分析主要scChIP-Seq、scATAC-Seq的转座酶可及染色质单细胞分析、scCUT&Tag以及scNMT-Seq等。

单细胞蛋白组。在单细胞水平上破译蛋白质组可以探索主要的功能细胞机制，然而单细胞蛋白质测序带来了巨大的挑战，因为使用现有技术不可能扩增蛋白质序列。目前用于单细胞蛋白质组测序的技术可分为两类，即基于抗体的方法（如CyTOF、IMC、scWB和Proseek Multiplex等）和基于质谱（MS）的方法（如SCoPE-MS）。

单细胞代谢组。质谱技术的进步，如质量分辨能力的提高和灵敏度的提高，以及代谢物数据库的开发，使得在单细胞分辨率下对代谢组的研究成为可能。已经建立了几种基于MS的单细胞代谢组测序方法。

纵向扩展

scRNA-Seq技术与其他单细胞组学数据、非单细胞信息或在单细胞分辨率下分析细胞功能的技术的垂直整合已经成为一种趋势。

单细胞水平的多组学整合。CITE-Seq是一种测序技术，它将单细胞转录组测序与细胞表位蛋白质索引相结合，将细胞表型信息（如细胞表面标记物的蛋白质表达水平）与单细胞转录数据相结合；REAP-Seq和IN-Seq，可同时描绘单个细胞的转录组和蛋白质组，提高对免疫组学的理解；使用scDam和T-Seq对单个细胞中的DNA-蛋白质相互作用和转录组谱进行同时定量，以揭示伴随DNA与特定蛋白质结合事件的转录改变；使用如CORTAD-Seq，同一单个细胞中的G&T-Seq和DR-Seq可以精确地揭示目标基因组位点中的基因组改变，如SNP和CNV；使用scMT-Seq和scM&T-Seq同时分析单细胞水平的mRNA转录组和DNA甲基组。

与非单细胞数据整合以获得信息。空间分辨转录组学技术，如空间转录组学技术（ST）和10X Genomics Visium，提供了细胞在其形态学背景下的综合概况，改变了我们对转录复杂性的看法。除了整合空间信息外，还建立了原位基因组测序以研究基因组组织，这使得能够在完整的单个细胞内同时进行原位测序和基因组成像。目前已开发多个分析工具用于信息整合：

整合非单细胞数据，实现单细胞分辨率的创新功能。除了将多个单细胞组学数据与空间信息相结合以获得单细胞水平上细胞行为的知识外，还存在将单细胞组与其他技术相结合以实现单细胞分辨率上的创新功能的趋势。例如，CROP-Seq将scRNA-Seq与CRISPR筛选技术相结合，以实现单细胞分辨率的CRISPR筛查。

癌症治疗的转化进展

诊断标志识别

scRNA-Seq技术作为最早和最成熟的单细胞测序技术，已被用于鉴定生物标志物，以确定癌症相关细胞类型的丰度和功能状态，检测细胞内通讯和相互作用，区分病理上相关的TME，以及癌症发展和治疗反应的预后。例如，通过整合scRNA-Seq数据和临床大量基因表达数据得到的肿瘤相关的小胶质细胞/巨噬细胞介导的EGFR/HER2反馈模块，并定义为多层网络生物标志物，已被证明在预测胶质瘤患者生存结果和治疗反应方面优于传统的胶质瘤基因签名。许多计算工具已经建立，以帮助从高通量数据（包括单细胞测序）中识别生物标志物。

治疗和疗效

癌症患者可能由于单细胞的耐药性和转移而对治疗没有反应。不同患者之间的肿瘤样本的异质性构成了治疗失败的另一个重要原因，这两个原因导致大约90%的现有药物对不到一半的患者有效。因此，了解单个肿瘤细胞的功能状态并确定细胞群的组成和特征，对于有效设计 疗法和治疗策略具有深远意义。通过治疗后的异种移植scRNA-Seq分析，Wu等人提出了一种新的肝细胞癌治疗策略，将IR820纳米胶囊增强声动力疗法与RAS抑制剂法甲酰基硫代水杨酸相结合。

越来越多的证据表明TME对肿瘤表型和药物敏感性的影响，为靶向治疗提供了新的方向。单细胞测序可用于探索恶性细胞及其TME之间的动态相互作用，其中以调节模块等形式输出的结果可能会推进我们对耐药肿瘤对药物治疗的敏感性的重新认识。例如，通过描绘肿瘤细胞及其TME之间的复杂相互作用并识别治疗靶点，scRNA-Seq已被用于克服具有激活HRA突变的化疗耐药转移性、肌肉浸润性尿路上皮性膀胱癌患者的治疗耐药性。

单细胞测序可用于识别对各种化学药物反应的异质性细胞行为。例如sci-plex技术的建立是为了破译数百万恶性细胞对不同化学药物的转录组改变，并以单细胞分辨率和低成本揭示药物反应背后的转录组轨迹。

由于篇幅有限，更多技术细节可参考文献原文 ：https://doi.org/10.1093/bfgp/elac011

参考文献
Dai X, Cai L, He F. Single-cell sequencing: expansion, integration and translation[J]. Briefings in Functional Genomics, 2022, 21(4): 280-295
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