Annu Rev Neurosci.综述：神经解剖学中的空间转录组学

今年4月《Annual Review of Neuroscience》刊出题为“Spatial Transcriptomics: Molecular Maps of the Mammalian Brain”的综述文章，回顾了在推进神经解剖学的背景下空间转录组学所带来的技术和概念进步，并讨论了分子神经解剖学如何重新定义神经系统定位。

神经解剖学是对神经系统的结构-功能关系的研究，实质上是为了开发一个正式的系统，将大脑的空间划分为代表生物或功能意义的离散区域的描述。空间转录组（ST）为揭示和描述大脑组织提供了一个强有力的解决方案：它引入了基于生物信号的空间区域无偏分类，为比较神经解剖学和脑回路功能分类开辟了新的可能性。

神经解剖学中的基因表达

在过去的几十年中，基因表达图谱改变了我们定义细胞识别和组织结构的方法，并在神经解剖学中引入了一个新的维度。

绘制细胞基因表达图谱的方法

转录组学技术（即用于研究生物体转录组（RNA转录物集合）的技术）的发展，特别是单细胞转录组测序（scRNA-seq），极大地促进和加速了神经元多样性的研究，计算工具的进步改变了大规模测序数据的分析方式。例如使用成年小鼠大脑scRNA-seq的研究已经建立了细胞类型的基本目录，也揭示了反映大脑中空间组织的基因表达。单细胞测序方法的主要限制是要求组织解离以收获单细胞，无形中分离了空间和分子的映射关系。Patch-seq方法通过结合电生理特征、形态学、定位和基因表达的映射来说明基因表达与神经元空间位置之间的关系（但其牺牲了可拓展性）。

组织中基因表达可视化的方法

将转录组学技术应用于神经解剖学的能力在于能够以极高的分辨率绘制组织中的基因表达信号。绘制完整组织中转录组的大多数方法的灵感来自原位杂交（ISH），该方法引入了一种基于探针与预定和选定的RNA分子的杂交来可视化RNA在细胞或组织（即原位）中如何分布的可能性。成年小鼠大脑最广泛的ISH图谱被编入Allen Institute for Brain Science生成的基因表达图谱，该资源汇编了来自整个成年小鼠大脑的冠状面和矢状面切片中约20000个基因的表达，并建立了可视化和探索基因表达数据的新标准(http://mouse.brain-map.org/)。

随着时间的推移，越来越灵敏的定量方法已开发出来，提供了以细胞分辨率绘制任何基因（或多个基因）表达图谱的可能性。例如RNAscope、smFISH、ISS、MERFISH、seqFISH+、osmFISH、STARmap、FISSEQ等。

空间转录组学

随着基于ISH方法绘制组织中基因表达图谱的进展，可以以非常高的分辨率绘制选定数量的基因的表达。然而，对整个大脑的转录本进行量化（例如成年小鼠的大脑），需要一种可扩展的方法，并以高空间分辨率捕捉基因表达。ST方法引入了一种创新的方法，通过无偏的高通量RNA测序（即不选择候选基因）在超细胞尺度上定量绘制组织切片中的基因表达谱。第一代ST阵列建立在印有容纳寡核苷酸（捕获）探针玻璃载玻片的基础上。

完善ST的一个重要步骤是同时提高灵敏度（即检测到的基因和动态范围）和分辨率（即spot大小）。Visium array (10x Genomics)改善了空间分辨率，允许从较小的spot（直径55微米）检测基因表达信号。为了接近单细胞分辨率，基于沉积在表面的条码珠，开发了Slide-seq和HDST。随后一个改进的Slide-seq版本（Slide-seq2）被开发出来，其灵敏度提高了10倍。除了提高分辨率外，增加ST阵列的尺寸以用于大脑较大的哺乳动物物种也很重要，目前商用ST阵列的尺寸可以最大限度地适合成年小鼠大脑半球的冠状切片（每个阵列6.5 mm×6.5 mm），扩展ST技术以匹配人脑区域（如人脑皮层）的尺寸需要将阵列表面扩展至少两个数量级。

ST实验可以生成非常大的测序数据集，带来与大规模scRNA-seq实验相同的计算挑战。由于ST和scRNA-seq数据的结构相似，已开发的scRNA-seq标准分析流程可以扩展到ST数据，例如Seurat和Scanpy等。此外，还开发了专用ST分析流程（👉 空间转录组数据分析方法最新进展）。

神经解剖学中的空间转录组学

用数据驱动的方法来定义大脑组织，消除基于专家定义所带来的潜在偏见，将是建立大脑参考图谱的理想框架。Ortiz et al.（2020）[1]使用基因表达的无偏ST图谱来开发数据驱动的分子图谱的概念，通过捕获来自75个冠状组织切片上34000个ST spots的约15000个基因的表达，构建了一个全脑分子图谱。通过对所有切片进行成像，然后在小鼠大脑的CCFv3中进行图像配准，确定组织中每个spot的位置，从而形成每个spot中每个基因表达的全脑视图。为了揭示组织中分子和神经解剖组织之间的关系，使用了无监督算法来识别具有共同分子特征的spots，随后在参考坐标系统中对分子集群进行了可视化。为了促进分子集群的三维可视化，机器学习被用来根据spots的身份和分布来定义连续的体积，生成一个具有分子定义的大脑区域三维图谱。总之计算分析无偏地将成年小鼠的大脑分为181个独特的分子域（https://www.molecularatlas.org/）。基于ST分类在生成新图谱方面的价值得到了支持，分子域显示了与目前基于结构参考图谱的高度一致，重要的是，还在几个脑区建立了新的更精细的细分，包括同源皮质和纹状体。

从scRNA-seq实验中可以看出，神经元的身份不能通过单一基因的表达来准确定义，而必须结合几个基因的表达来捕捉神经元亚型的多样性。同样，即使单个基因的表达可以揭示大脑组织的某些方面，也不可能用少量的基因来代表全部的神经解剖学复杂性。完整的分子图谱是基于7000个最易变的基因的表达，证明了基因表达作为绘制成人大脑图谱工具的能力。作为一种可能的解决方案，Ortiz et al.（2020）[1]的研究表明，通过使用266个空间定义基因将大脑分类为181个分子簇，可以仅使用一小部分基因来重现大部分全脑神经解剖学分类细节。总之，全脑ST的首次应用清楚地展示了数据驱动的分子神经解剖学在全脑尺度上的潜力，它为哺乳动物大脑组织的无偏分类提供了路线图。

这一新时代利用了高分辨率分子工具，实现了大规模标记图谱的绘制，以无偏和无监督的方式捕捉神经系统的复杂性。在这方面，ST提供了一个路线图来定义和研究任何物种的大脑区域，重要的是，独立于先前的神经解剖学知识。

未来，需要重点考虑定义需要多详细才能最好地服务于开发神经解剖学框架的目的，以支持对大脑功能的理解。

本文的研究团队预计，空间限制的基因表达特征在哺乳动物物种间是保守的，ST方法可以指导包括人脑在内的几个物种新图谱的开发。完整的脑组织中RNA分布的大规模成像将是未来几年需要解决的一个重要挑战，因为目前最先进的方法仅限于现实对小的组织体积成像。分子图谱[1]与高清晰度、特定细胞类型的“布线图”[2]和全脑活动图谱相结合，可以为建立新的参考图谱提供信息，并为理解神经系统如何组织形成行为提供一个统一的框架。

参考文献
[1] Ortiz C, Navarro J F, Jurek A, et al. Molecular atlas of the adult mouse brain[J]. Science Advances, 2020, 6(26): eabb3446.
[2] Huang L, Kebschull J M, Fürth D, et al. BRICseq bridges brain-wide interregional connectivity to neural activity and gene expression in single animals[J]. Cell, 2020, 182(1): 177-188. e27.
[3] Ortiz C, Carlén M, Meletis K. Spatial Transcriptomics: Molecular Maps of the Mammalian Brain[J]. Annual Review of Neuroscience, 2021, 44.
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