前沿综述 | 单细胞-蛋白组分析技术及其应用

之前我们已经分享了很多关于单细胞转录组测序（scRNA-seq）的实验技术、分析方法、数据集等，那么以蛋白质组为目标的单细胞分析技术有哪些？它们有哪些应用？

来自加拿大的研究团队在《Nature reviews chemistry 》发表了单细胞蛋白组技术相关的综述，回顾了单细胞蛋白组分析技术，并评估其优势和局限性。所介绍的新兴技术有可能揭示对肿瘤异质性和治疗耐药性的新见解，阐明免疫反应和免疫疗法的机制，并加速药物的发现。

单细胞蛋白组分析工具

目前还没有在单细胞水平上进行全蛋白组分析的工具可供商业使用，但已经开发了几种技术用于高复用蛋白分析。最广泛使用的方法有：基因编码荧光蛋白与高分辨率成像相结合；基于抗体的策略与流式细胞术或微流控技术相结合；以及质谱技术。

用于蛋白分析的荧光探针

GFP是一种基因编码的报告基因，由于荧光蛋白具有良好的生物相容性，在大量的单细胞蛋白质分析研究中，人们利用基因转染技术将荧光蛋白与目的蛋白连接起来。毛细管电泳（CE）是一种很有前途的单细胞分析细胞质蛋白的工具。在荧光团的光转化过程之后检测荧光的远场成像方法，例如光激活定位显微镜，揭示了RAS的二聚依赖性信号机制。

但实现荧光蛋白融合文库的分析方法受到读出次数的限制，读出次数受可用荧光团的光谱重叠的限制，并且如果荧光蛋白和宿主蛋白之间的连接体不够长且不稳定，则可能发生对天然蛋白功能的潜在阻碍。此外，这些蛋白对于应用样本也有限制，其跟踪时间不能超过它们的光漂白点，这限制了它们在长时间尺度实验中的应用。

基于抗体的蛋白分析

基于抗体的单细胞蛋白检测可以与显微镜、流式细胞术或微流控平台相结合，生成高通量的数据集。1）显微技术，如免疫细胞化学和免疫组织化学，是最简单的单细胞蛋白质检测，可以提供单细胞分辨率的蛋白质定位的空间信息；2）流式细胞术，荧光激活细胞分选（FACS）是最成熟的蛋白分析方法，其通常用于分析和分类活细胞，对于分离特定的细胞表型以进行后续的下游分析非常有用。流式细胞术的一个主要缺点是在制备过程中细胞间失去接触。此外，细胞受到机械剪切力的作用，这种剪切力可改变细胞内的信号传递行为；3）通过飞行时间进行细胞计数，飞行时间质谱流式细胞术（Cytometry by time of flight，CyTOF）是分析细胞表面和细胞质蛋白的最先进技术之一，其还可用于分析固定组织，从而为免疫组化分析提供了一个强有力的选择。这项技术还可以与免疫细胞化学和免疫组织化学方法相结合，以亚细胞分辨率同时成像多达32种蛋白和蛋白质修饰。CyTOF还可以促进高维单细胞CRISPR筛选。然而，CyTOF不能对活细胞进行分类。其他缺点包括商业金属同位素标记抗体的有限可用性以及与大数据集的质量控制和分析相关的挑战。由于回收率不是100%，因此CyTOF也很难用于小细胞集的单细胞水平检测。4）微流控平台，基于微流控技术的单细胞蛋白质测量工具包括液滴微流控技术、微刻方法、单细胞条形码芯片（SCBCs）、单细胞Western印迹和磁排细胞仪（MagRC）。这个领域非常活跃，正在产生许多新的系统。

质谱技术

质谱在蛋白质组学中取得成功的根本原因在于其固有的特异性和理论上延伸到单一离子的高灵敏度。尽管目前的质谱分析方法在灵敏度和细胞通量方面受到限制，但使用液滴微流体将样品体积从微升减少到纳升无疑可以提高其分析性能。目前，质谱法普遍用于蛋白分析。

单细胞的蛋白组+转录组分析

将蛋白组学和转录组学分析整合到单一的多组学方法中提供了在单个细胞中检测RNA表达和蛋白质丰度的动力学可能性，这反过来可能产生对复杂调控过程的机制性见解，例如表观基因组、转录和转录后基因监管。此外，同步的mRNA和蛋白质分析可用于确定mRNA和蛋白质水平在活跃的转录后调控期间相关性较差的细胞状态。

最直接的分析蛋白质水平和RNA表达的方法是使用单个细胞的索引FAC同时测量同一细胞中的少量蛋白质和相应转录物的水平。另一种方法依赖于邻近延伸分析（PEA）与RNA分析并行进行蛋白检测。

邻近连接分析（PLA）依赖于两个抗体结合的寡核苷酸在同一蛋白质靶点上的连接而不是杂交。这种方法被用来研究蛋白质-蛋白质相互作用的亚细胞定位，例如RNA的PLA在mass-cytometry工作流程中实现，以便能够同时定量单个原代人类外周血单个核细胞中的10个转录物和相应蛋白质。

通过测序、RNA表达以及蛋白测序分析对转录组和表位进行细胞索引的两种方法利用与DNA条形码结合的抗体，以便能够在单细胞水平上同时分析细胞表面蛋白质和mRNAs。CyTOF与单细胞RNA测序相结合可以追踪树突状细胞（DC）谱系的发育。

可以想象，将单细胞蛋白组学方法与多组学工具相结合，可以促进我们对细胞过程的理解，特别是对癌症抵抗机制和治疗反应多样性的理解。

单细胞蛋白组学工具的应用

了解肿瘤异质性和治疗耐药性

病理学家早就认识到许多蛋白质在肿瘤细胞中的不均匀表达。例如大多数B细胞恶性肿瘤患者用靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞治疗。这些患者最初对治疗有反应，但约30%的患者复发，因为肿瘤细胞表达由选择性剪接产生的CD19亚型，并且缺乏编码抗原表位的外显子。在这些情况下，单细胞蛋白质组学工具可用于全面研究治疗性耐药的机制——无论是预先存在的和/或获得性的——并因此采取更有效的治疗策略。

癌症免疫治疗

单细胞蛋白分析已被用于表征T细胞亚型及其祖细胞，以及它们在不同免疫疗法诱导下对癌症的反应。此外，单细胞蛋白质组学结合T细胞受体链和配对新抗原的DNA测序提高了我们对这种配对的认识，并指导了一些癌症免疫治疗策略。单细胞蛋白分析方法也支持了采用性细胞转移方法的进展。

高通量药物筛选

高通量药物筛选能够全面评估生物活性分子对单个人细胞的影响，可以为临床前开发提供有价值的指标，并最终基于对患者细胞表型的离散性知识指导治疗选择。例如CyTOF可以通过对每个细胞进行条形码编码来评估药物库对具有深维度的单个细胞的影响、每个细胞具有独特的质量特征、报告其位置和每种药物的测试剂量。

随着单细胞蛋白质组学技术的不断发展和成熟，每个细胞可以测量的参数数量和分析的细胞数量都将继续增加。单细胞蛋白组学和相关数据分析的未来发展可能会成为扩大和完善单细胞多组学方法所需的关键基石，使我们能够建立一个全面的人类细胞图谱，包括人体的每一个细胞，以及关键模型生物的配套图谱。虽然目前可用的工具正在为复杂的生物现象提供前所未有的可视化和分辨率，但还是需要下一代的单细胞检测来提供更广泛的蛋白质组覆盖面。

参考文献
Labib, M., Kelley, S.O. Single-cell analysis targeting the proteome. Nat Rev Chem 4, 143–158 (2020). https://doi.org/10.1038/s41570-020-0162-7
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