2021-01-11 9810文献解读
空间转录组学的发展极大地扩展了复杂多细胞生物系统的知识。那么大家常常提到的空间转录组技术都有哪些技术?
今天小编分享的这篇发表在《BioEssays》的文献综述了现有的空间转录组学方法,讨论了它们的应用及其优缺点。
捕捉空间基因表达信息的方法只是通过从样本中分离出目标区域,然后将这些区域单独放入试管中进行RNA提取和后续的基因表达谱分析。虽然解剖单个区域进行后续的测序可以完整地提取不同形式的RNA种类,实现同工型存在等分析,但一般来说,覆盖较大的区域通常很麻烦,而且在整个组织中获得整体情况往往是不可行的。
激光捕获显微切割(LCM)是一种利用激光束在显微镜下切割组织区域的技术。2017年,LCM方案的一个扩展版本Geo-seq,将LCM与scRNA-seq相结合,以分析小到10个单细胞组织区域的转录组。
2014年描述的一种叫做RNA断层扫描(tomo-seq)的冷冻切片方法通过线性扩增单个组织的cDNA。与早期的冷冻切片方法相比,这种方法在RNA定量和空间分辨率方面都有优势。然而,使用tomo-seq的转录组图谱只能用相同的生物样本构建,因此不能应用于临床样本。
TIVA是一项能够实现活细胞空间转录组学的技术。它通过细胞穿透肽,将一个光激活的生物素标签引入活细胞中。通过对选定的区域或单细胞进行光激活,poly(U)序列暴露出来,并与细胞mRNA的poly-A尾退火。之后利用链霉亲和素与标签上的生物素相结合,可以收集捕获的mRNA,进一步用于RNA-seq。虽然它可以应用于活体组织,但它的主要限制是其通量低,一次只能分析少数单个细胞。此外,对活组织的应用限制了它在模型系统分析中的应用。
NICHE-Seq在一个特定区域(组织内拥有特定微环境的区域)内,对单个细胞的转录组进行剖析。这项技术通量非常高,可以分析一个区域内的数千个细胞,但他们在光激活区域内的确切位置是未知的。由于目前的流程依赖于基因工程模型生物,它不能应用于人类样本。
ProximID通过观察细胞之间的实际物理相互作用,通过在温和的条件下解离组织,从而保留包含两到三个细胞的小型相互作用结构来实现。然后手动微解剖和单个细胞作为主体进行scRNA-seq。然而,手动显微解剖使该技术有点劳动密集型,因此在通量方面是有限的。
不从组织内的各个部分(或细胞)中提取RNA分子,而是直接在其原始环境中对其进行可视化,这可以通过与感兴趣的目标互补的标记探针杂交来实现。
原位杂交(ISH)利用标记的核酸探针来确定组织和细胞中DNA和RNA的空间位置和丰度。之后不断进化,形成了单分子RNA荧光原位杂交技术(smFISH)。smFISH利用多条短的寡核苷酸探针(大约20 bp)来靶向同一mRNA转录本的不同区域。2008年开发了一种替代性的smFISH方法,使用一组≈40个探针(20bp),每个探针耦合到一个单一的荧光团。虽然smFISH具有高灵敏度和亚细胞空间分辨率,但由于标准显微镜中光谱重叠的固有限制,它一次只能针对几个基因。
seqFISH是一种多路smFISH方法,通过连续几轮杂交、成像和探针剥离,多次检测单个转录本。然而,杂交轮数的增加需要增加smFISH探针的数量,这使得seqFISH既昂贵又耗时。
为了弥补seqFISH的大量耗时,2015年发布了MERFISH技术。这种技术可以鉴定单个细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位。它利用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量,并通过二进制条形码来抵消单分子标记和检测错误。2018年,MERFISH技术与扩张显微镜相结合,通过扩大RNA目标之间的距离,可以在没有光谱重叠的情况下使检测到的分子数量增加。
2019年,seqFISH的研究小组也采用了与MERFISH有些相似的方法,即使用包含侧翼区域的主探针一步定位,随后多次读取探针循环。该方法允许使用标准共聚焦显微镜的10000个基因的目标复用,而不需要超分辨率设备。然而,这种策略仍然是基于先验地决定目标,并且需要使用大量的合成探针集。
osmFISH是一种非条形码技术,osmFISH的靶点数量设置为杂交轮数,其中每一轮杂交包括一定数量的基因的探针集。每一轮杂交后,获得图像,然后去除探针,进行下一轮杂交。虽然osmFISH与其他smFISH技术相比具有较低的复用能力,但它在处理较大组织区域的能力方面表现突出。
2011年,Advanced Cell Diagnostics推出了商业化的RNAscope芯片。该检测的核心是探针设计,两个相邻的 "Z-probes "与目标RNA转录物结合,形成所需的结合位点,供后续的放大分子杂交使用。2019年7月,同时检测RNA靶点的最大数量增加到12个。低倍数RNAscope还与成像质粒细胞仪(IMC)相结合,用金属标签代替荧光团对DNA树进行杂交。随后,将金属结合的抗体添加到同一组织切片,并进行金属丰度的质细胞测量,允许同时进行RNA和蛋白质评估。
2019年,提出了一种被称为 "DNA显微镜 "的核苷酸无光学图谱,它不依赖于从已知位置的物理捕获,而是依赖于热力学熵。与传统的成像方法相比,DNA显微镜的原理意味着一个相当奇怪的反向特征,信号的稀疏性成为挑战,而高信号密度意味着更容易重建。迄今为止,该技术只对培养细胞上的一小部分转录本进行了演示。
RNA测序可以直接对细胞中的RNA含量进行测序,而细胞仍处于其组织环境中。转录物的位置可以用亚细胞分辨率来解决,但为了达到足够的信号进行成像,需要使用微米或纳米大小的DNA球来放大信号。
2013年,发表了第一个ISS方法,该方法使用挂锁探针来靶向已知基因。在完整的组织切片内,mRNA首先被逆转录为cDNA,挂锁探针可以结合到其上。挂锁探针是一种单链DNA分子,含有与目标cDNA互补的区域。虽然带有挂锁探针的ISS有利于亚细胞分辨率,但由于测序读出长度短和RCP的大小,目标数量有限。2019年,ISS检测在微流控平台上实现了自动化。
BaristaSeq是另一种基于缺口填充挂锁的方法,其读取长度增加到15个碱基。BaristaSeq展示了与传统的间隙填充挂锁ISS相比,RCP形成的定量增加了5倍,与FISSEQ相比更是如此。但需要注意的是,该方法仅在培养细胞上进行了展示。
STARmap使用条形码挂锁探针,与靶标杂交,但通过添加第二个引物,针对挂锁探针旁边的位点,避免了逆转录(RT)步骤。这种方法避免了cDNA转换的效率障碍,并通过增加第二个杂交步骤来降低噪音。在介绍该方法的文章中,最吸引的特点是能够对完整的组织样本进行3D分析,保留了细胞的方向性,而不仅仅是单一的2D层。但需要注意的是,这种能力只表现在100~150微米厚的切片和较少的目标数量上。
到目前为止,所提到的方法都是基于对靶标的先验知识,FISSEQ是一种非靶标的方法,即捕获所有种类的RNA。2019年,FISSEQ的研究小组又提出了原位转录组可及性测序(INSTA-Seq)。通过这种方式,规避了典型ISS方法对短读信息的限制。
迄今为止所描述的空间技术是基于以下两种情况:分离已知的感兴趣的组织区域,或通过杂交或测序对RNA分子进行原位可视化。另一种方法是在原位捕获转录物,然后进行异位测序。
2016年发表的空间转录组学(ST)技术可以得到空间分辨的全转录组信息。2018年底,ST技术被10X Genomics公司收购并进一步开发,命名为 "10X Visium"。"10X Visium检测法在分辨率(直径55µm,条形码区域之间的距离更小)以及运行时间上都有改进。
代替在玻片上打印区域条形码RT引物,人们可以将它们附着在溶液中的珠子上,然后将它们分配到玻璃表面。这一方法是由Slide-seq技术的研究团队在2019年采用的。与其他原位方法相比,组织图像是从相邻切片获得的,而不是从相同的切片获得RNA数据。
在Slide-seq方法发表后不久,另一种使用更小的条形码珠子的技术发布,命名为高分辨率空间转录组技术(HDST)。
Nanostring GeoMx Digital Spatial Profifiler的差异化在于它能够应用于FFPE样品。该仪器还具有空间剖析蛋白质的能力,尽管不是在同一组织切片上。它以迭代的方式工作,用户通过不同大小的显微镜(直径10-600 µm)手动选择感兴趣的区域(ROI)。
APEX-Seq可以对单个活细胞内的内源性RNAs的亚细胞定位进行分析。由于APEX-Seq需要重组技术,因此该方法不适用于正常组织。
除了前面介绍的实验方法外,还有构建空间解析基因表达数据集的计算方法。这些技术从解离的单细胞开始,旨在根据基因表达谱,通过计算将其分配到一个空间位置。细胞到空间位置的映射可以基于参考图(其中使用一组信息性的基因签名来指导细胞的适当放置)来实现,或者可以基于关于跨越物理空间的表达特征的假设来重新寻找。
做空间转录组研究容易忽略的注意事项:
目前,空间转录组技术大多数情况下还只是应用于基础研究。但是,这些技术可能会成为个性化医学的重要工具,在一些组织中,局部作用的免疫反应和克隆可能对于治疗诊断十分重要。而这些技术应用于临床还需要解决工作流程复杂,费用较高等问题。
技术发展的一个驱动力是一些正在进行的大型合作研究,以创建全面和公开可用的数据集。同时,需要建立新的分析工具和标准化程序,以便能够将所有这些不同的技术结合起来,每种技术都有其独特的特点、数据格式、优势和注意事项。空间转录组学领域正在加速技术进步,而这一进展使许多生物学分析成为可能。
参考文献Asp M, Bergenstråhle J, Lundeberg J. Spatially Resolved Transcriptomes—Next Generation Tools for Tissue Exploration[J]. BioEssays, 2020: 1900221.
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