Science子刊：发布十亿级通量的核酸蛋白互作平台DocMF | CNGBdb支撑发表科研成果速递

2020年7月31日，国际著名期刊Science Advances杂志在线发表了深圳华大生命科学研究院的题为“DNB-based on-chip motif finding (DocMF):A high-throughput method to profile different types of protein-DNA interactions”（DocMF: 一种基于DNA纳米球技术的在芯片上高通量鉴定不同蛋白-DNA互作位点的平台）的研究论文。

目前研究蛋白质与DNA相互作用的靶向序列的方法有很多，常用的有微阵列技术（PBM：Protein-Binding Microarray）或者SELEX，但是这些方法通常费时费力且通量不够高。与这些技术相比，DocMF除了能检测出更多的蛋白和DNA结合位点，还能在DNA分子被蛋白切割后，大规模地提供有关与蛋白质相互作用的Motif信息。因此，DocMF是目前第一个能够同时鉴定蛋白切割位点以及蛋白与DNA靶向结合位点的高通量平台。

支持该研究结果的数据已保存在国家基因库生命大数据平台（CNGBdb），项目编号：CNP0000723

DocMF是什么？

DocMF是一个以DNA纳米球（DNBSEQTM）技术为基础的，使用高通量测序芯片来分析蛋白质-DNA相互作用的高灵敏度、高通量的鉴定平台。

DocMF利用华大智造独有的DNBSEQTM测序技术和两次成像拍照结合的方法来检测蛋白质-DNA相互作用中所涉及的切割或者结合所需的特异性靶向序列。从单个DNB的序列信息和荧光信号变化，我们可以找到与蛋白质发生相互作用的所有序列，并通过生物信息学分析确定特定的靶向序列。测序芯片的通量可以允许一次性筛选十亿级别、带着不同序列的DNA纳米球，大大高于PBM或者SELEX的通量，DocMF能够很灵敏地找到弱结合力的所有互作位点序列。

DocMF能做什么？

使用该系统，研究团队成功地鉴定了常用核酸内切酶的识别位点（restriction sites），以及CRISPR/Cas蛋白特异性识别所需的PAM序列。

研究人员首先鉴定了不同类型的限制性内切核酸酶以及CRISPR/Cas的识别位点。最新基因编辑工具CRISPR/Cas系统是存在于多数细菌和古菌中的一种后天免疫系统，经生物学家改造后，可高效、便捷地实现基因定点修饰。此类Cas系统包含三个核心元件-Cas核酸酶，引导RNA（gRNA），间隔序列前体临近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM序列对Cas蛋白特异性识别靶序列至关重要,也是CRISPR/Cas系统发挥功效的关键特性之一。目前，现有的技术（E.coli双抗实验，Cas核酸酶切后高通量测序等），对PAM序列的鉴定仍存在不同的缺陷，如耗时长、灵敏度低等。利用DocMF，研究人员发现SpCas9除了经典的5’-NGG-3’的PAM外，还有两个较为少见的5’-NAG-3’和5’-NGA-3’的PAM序列，并且算出NAG出现几率在5%左右，而更弱结合力的NGA只有1.6%。

文章还探索了两个未发表的新型CRSIPR/Cas蛋白，VeCas9和BvCas12a。其中VeCas9的PAM序列用传统的E.coli双抗实验方法无法准确鉴定出。利用DocMF，这两个新型CRISPR/Cas蛋白的宽松PAM序列也均能被准确检出。同时研究人员还能根据芯片上信号变化比值，对不同PAM序列的活性排序，找出结合力最强的PAM序列，有助于设计体内基因编辑的最佳靶向位点。同时文章作者也讨论说明DocMF还可以被用来寻找Cas蛋白的脱靶序列。因此，DocMF为新型基因编辑系统的研究提供了一个强有力的工具，将会更快地推进更多新型编辑系统的发现及其功能研究。

为研究蛋白与DNA结合靶向位点的鉴定，团队选用无切割活性的dCas9进行测试，筛选出NGG序列为dCas9的PAM特异性位点，该特异性NGG序列是与以前的报道一致的。同时研究人员也发现，由于蛋白上两个氨基酸的突变，导致dCas9无法像传统的Cas9一样对NAG和NGA序列进行靶向结合。

研究意义

DocMF平台基于华大智造测序仪，提供了一种检测多种蛋白质-DNA互作靶向位点的高通量的方法。整个鉴定流程耗时约三天，包括文库的制备、测序及分析，极大的缩减了工作时间及工作量。由于其高深度和高通量，也极大地提高了检测的准确性。

文章通讯作者之一、华大研究院院长徐讯表示，DocMF不只是全球唯一的能兼容鉴定蛋白与DNA结合或切割靶向位点的高通量平台，也具有鉴定CRISPR系统脱靶位点、转录因子结合位点的潜力。DocMF平台的开发，为后续蛋白质-DNA互作的研究提供了一个强有力的工具，同时此研究也扩展了以DNA纳米球为基础的测序技术的应用范围，体现了国产化基因测序平台研究工具的优势。

如何将数据存储至CNGBdb并完成文章发表？

CNGBdb 的数据[存]储功能由旗下的国家基因库序列归档系统（CNSA，db.cngb.org/cnsa）负责，这是国内首个实现在线批量上传和审编的组学数据归档库，可支撑全球科研成果发表。截至2020年7月31日，CNSA已支持论文发表147篇，发表期刊92个，包括Cell、Nature、Science、Lancet等。

参考文献：
Li Z, Wang X, Xu D, et al. DNB-based on-chip motif finding: A high-throughput method to profile different types of protein-DNA interactions[J]. Science Advances, 2020, 6(31): eabb3350.
信息来源：“BGI华大”公众号
图片来源：参考文献，Science官网，CNGBdb官网。