Nature Plants | 中国科研团队利用CRISPR/Cas系统实现水稻内源基因"敲高" ,创造新型抗除草剂水稻

2021-11-24 79CNGBdb

2021年11月15日,来自中国农业大学、贵州大学、中国科学院分子植物科学卓越创新中心和青岛华大等机构的科研团队于《Nature Plants》在线发表了以“A Donor DNA-free CRISPR-Cas-based Approach to Gene Knock-up in Rice”为题的最新研究成果,报道了一种“基因敲高”的新策略。

Nature Plants-1.png

支持本研究结果的数据已存储于国家基因库生命大数据平台(CNGBdb),项目编号为:CNP0001922 。

研究背景

以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术能够在基因组上产生精准突变,为动植物育种提供了革命性工具。由于基因编辑的最终产品不含外源基因,并且也可以通过传统诱变或自然突变获得,因此基因编辑作物在很多国家被视为普通品种。在美国上市的高油酸大豆,以及在日本上市的高γ-氨基丁酸番茄等都是基因编辑产品作为常规品种推广的案例。

目前,通过基因编辑技术来精准诱变基因的应用主要集中在两个场景:一是对基因敲除,这是目前基因编辑在育种方面最普遍的应用,上面提到的大豆和番茄就是基因敲除的两个例子。二是对基因进行点突变,即通过碱基编辑提升基因功能;已在美国推广种植的抗ALS除草剂油菜是就是通过碱基替换使内源ALS基因获得了抗除草剂的新功能。随着碱基编辑技术的快速发展,该领域的应用正日益深入。

鉴于大量的基因通过提升其表达量即可带来性状的改良,因此基因敲高(即上调基因表达)是与基因敲除、碱基编辑提升基因功能并列的第三大应用场景。上调基因表达的通用技术路线是在目标基因附近插入调控元件,例如强启动子、增强子等,从而提高目标基因的表达水平[1]。但是,由于插入整合了人工DNA,在推广应用方面可能会面临严格的监管。很显然,如果能够在不插入人工DNA的前提下实现上调基因表达,将在推广应用方面更具优势,但是,传统观点认为该技术路线很难实现。

主要研究内容

由于转基因过表达水稻PPO1和HPPD就能够分别带来对两种专利除草剂(中国自主知识产权)的抗性,本研究的核心问题是,如何在不整合人工合成DNA(作为强启动子)的前提下,利用基因编辑技术大幅“敲高”这两个基因的表达。

许多研究很早就发现,Cas9同时在一个基因的不同位置切割时,会造成删除、倒位、重复等基因组结构变异。研究团队突然意识到:只要在所要上调表达的目标基因(下图中所示的基因-1)附近找到高表达基因(下图中所示的基因-2)并选择恰当的位点切割,就能够创造出特定的结构变异,将高表达基因的启动子与目标基因相连接,形成图中所示的新的基因表达模式,从而大幅“敲高”目标基因的表达。

Nature Plants-2.png

据此,研究团队根据水稻转录组信息,分别在PPO1和HPPD附近找到了高表达基因CP12和Ubiquitin2,并采用如下图所示的设计,构建了双靶点CRISPR载体对水稻愈伤进行了大规模转化,成功地在水稻植株中创制了两种不同且可以稳定遗传的基因组结构变异。在被成功编辑的水稻植株中,CP12基因的启动子驱动PPO1基因的表达,Ubiquitin2基因的启动子驱动HPPD基因的表达,从而大幅“敲高”了水稻内源PPO1和HPPD基因,使水稻植株表现出预期的抗除草剂性状。抗除草剂品种配合高效的专利除草剂,有望为水稻田杂草防控提供更加高效的解决方案。

Nature Plants-3.png

研究意义

进一步深化了对基因编辑工具的认知和理解

长期以来,Cas9一直被作为基因敲除工具,而点突变及上调基因表达通常需要插入人工DNA模板,这是对基因编辑工具的传统认知。之前,该团队开发了“循环打靶”碱基编辑策略,通过双靶点的“循环打靶”设计将Cas9变成了全功能的碱基编辑器[2]。此次研究中,该团队设计了能够上调基因表达的倒位、重复等基因组结构变异,成功实现了对目标基因的敲高。因此,无需人工DNA模板,Cas9不仅能够敲除基因,还可以创制点突变和敲高基因,是名副其实的全功能基因及基因组编辑工具。

基因编辑创制基因组结构变异,是以自然为师而已

随着长片段测序技术的发展,在基因组层面上比较不同品种之间的差异成为可能,“泛基因组学”方兴未艾。大量泛基因组学研究表明不同品种之间存在大量的结构变异。一些重要的农艺性状就是基因组结构变异的结果[3-6]。例如,蟠桃和圆桃之间的果型差异就是由桃基因组上大片段的倒位导致[7]。水稻基因组上特定片段的重复能够影响籼粳杂交稻的育性[8]。因此,基因组结构变异是物种演化的重要推动力,是自然界中的普遍现象。通过基因编辑技术创制预期的结构变异,是以自然为师而已!

“基因敲高”有望成为基因编辑技术在动植物育种上应用的新领域

改变基因的表达模式是动植物遗传改良的重要方面,但是长期以来,主要依靠插入人工DNA来实现。本次研究提供了改变基因表达模式(尤其是敲高基因)的通用方法,不需要插入人工DNA,有望开辟基因编辑技术在动植物育种上应用的新领域。

中国农业大学2021届毕业生芦钰硕士、清原王继尧博士、陈波博士、莫苏东博士和贵州大学在读博士生连磊为本文的共同第一作者,中国农业大学姜临建副教授、青岛清原化合物有限公司李华荣博士、中国科学院分子植物科学卓越创新中心朱健康教授和贵州大学宋宝安教授为本文的共同通讯作者,青岛华大基因范广益博士、孙帅作为本文的共同作者对本项目的深度测序结果进行了生信分析。本研究得到了清原化合物和国家自然科学基金的资助。

参考文献
[1] Lu, Y. et al. Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice. Nat. Biotechnol. 38, 1402-1407, doi:10.1038/s41587-020-0581-5 (2020).
[2] Yang, W. et al. Programmed sequential cutting endows Cas9 versatile base substitution capability in plants. Sci. China Life Sci., doi:10.1007/s11427-020-1798-4 (2020).  
[3] Tao, Y., Zhao, X., Mace, E., Henry, R. & Jordan, D. Exploring and exploiting pan-genomics for crop improvement. Mol. Plant 12, 156-169, doi:10.1016/j.molp.2018.12.016 (2019).
[4] Zhang, H. et al. Gain-of-function of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene ACS1G induces female flower development in cucumber gynoecy. Plant Cell 33, 306-321, doi:10.1093/plcell/koaa018 (2021).
[5] Liu, Y. et al. Pan-genome of wild and cultivated soybeans. Cell 182, 162-176 e113, doi:10.1016/j.cell.2020.05.023 (2020).  
[6] Jayakodi, M. et al. The barley pan-genome reveals the hidden legacy of mutation breeding. Nature 588, 284-289, doi:10.1038/s41586-020-2947-8 (2020).  [7] Guan, J. et al. Genome structure variation analyses of peach reveal population dynamics and a 1.67 Mb causal inversion for fruit shape. Genome Biol. 22, 13, doi:10.1186/s13059-020-02239-1 (2021). 
[8] Shen, R. et al. Genomic structural variation-mediated allelic suppression causes hybrid male sterility in rice. Nat. Commun. 8, 1310, doi:10.1038/s41467-017-01400-y (2017).
[9] Lu, Y., Wang, J., Chen, B. et al. A donor-DNA-free CRISPR/Cas-based approach to gene knock-up in rice. Nat. Plants 7, 1445–1452 (2021). https://doi.org/10.1038/s41477-021-01019-4
信息及图片来源:“植物生物技术Pbj”公众号

上一篇下一篇

相关专题