癌症分析【第2课】测序下机数据处理（上）

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上一期的动手实验室的热身，小伙伴都和Docker玩起来了吗？后面的小课堂将会给大家带来更多实用、好玩的动手体验~！

本次课程，我会给大家留探索思考题，鼓励小伙伴们使用google/百度搜索引擎来找到你的答案，以留言/群互动的方式，共同探讨、共同学习，一起成长。所以，我们互动起来吧~！

第二课：从测序下机数据开始处理（上）

在这一次课里，我们将会学习如何是对原始测序下机数据（reads）进行质控。主要的步骤包括从数据库中找到下机数据并下载，了解下机数据Fastq格式，使用工具对下机数据进行质控和理解质控报告四个部分。

Step1 从CNGBdb搜索并下载测序数据

国家基因库大数据平台CNGBdb有丰富的生物信息资源哦，我们将从CNGBdb上搜索找到一套合适的测序下机数据，并且下载下来。

测试数据（点击阅读点击原文可下载，建议电脑端操作）https://db.cngb.org/search/project/CNP0000368/

NA12878是千人基因组项目中一个常用的细胞系样本，常应用在测序技术和生物信息的方法评估中。详细信息请浏览http://www.internationalgenome.org/data-portal/sample/NA12878。

Step2 认识FASTQ格式的数据

FASTQ是基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式。FASTQ文件中每个序列通常有四行：
第一行，以‘@’开头，read名；若是paired-end，则带有read1、read2的标识
第二行，read序列
第三行，以‘+’开头
第四行，对应第二行每一个碱基的质量信息（Phred Quality Scores）

碱基的质量信息（Phred Quality Scores）详见：https://www.phrap.com/phred/两种测序的方案，Single-end和paired-end（如图所示）。Single-end的测序数据，只有1个fastq文件，而paired-end的测序数据，则有2个fastq文件，分别存储reads1和reads2的信息。本次从CNGBdb数据库中下载的是paired-end的数据。

Step3 使用Fastp进行下机数据质控

fastp是一款较新的数据质控软件，可对测序下机数据进行全方位自动化的质控（无需复杂的参数设置），包括对reads进行过滤，去除低质量、过段或太多N的reads，自动检测接头序列并去接头，生成质控报告等，并且运行速度非常快（演示中对大小为2G的测序数据进行质控，只需不到5 min）。软件信息详见 https://github.com/OpenGene/fastp

• 从docker hub中下载一个fastp

docker pull joshuagad/fastp:latest

• 进入容器

docker run -it -v D:\CancerPipeline\L2_Reads_Clean:/data joshuagad/fastp:latest

• 查看Fastp说明

fastp

• 运行fastp质控

fastp -i V100007471_L03_539_1.fq.gz -o V100007471_L03_539_1.clean.fq.gz -I V100007471_L03_539_2.fq.gz -O V100007471_L03_539_2.flean.fq.gz

Step4 下机数据质控报告

Fastp运行结束后，会在屏幕中打印部分的质控报告；在生成的fastp.html文件中，可以看到详细的网页报告，包括：

1. reads过滤前后数据量统计
2. reads重复率（实验扩增引入，越低越好）
3. Insert size（read1和read2之间的距离）
4. 质量值分布，Q20和Q30比例
5. GC含量
6. 自动检测接头信息
7. N含量
   ……
   

质控生成的过滤后的fq文件，将用于后续的比对。我们的测序下机数据质控，就完成了。

探索题 如何根据reads重复率、Q20和Q30比例，GC含量等量化指标，来评价一份测序数据的质量呢？ 

动手试一下吧~！别忘了，动手实验室鼓励小伙伴们通过使用搜索引擎Google/百度来寻找你所遇到问题的答案，以留言/群互动的方式互动，共同探讨、共同学习，一起成长！更多精彩课程，欢迎继续关注！