<2019第十期课程回顾>CRISPR/Cas9基因编辑系统在肿瘤免疫治疗中的应用

课程回放：

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CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦!
2019年11月19日<第十讲>上线
课程名称：CRISPR/Cas9基因编辑系统在肿瘤免疫治疗中的应用

讲师：高千千，华大生命科学研究院超级细胞所生物技术副研究员，博士毕业于北京大学，盐田“梧桐凤凰”人才，华大基因学院硕士生导师。2019年获得BGI Women Speaker Award，参与ICG-14第五届Women in Science Conference并作报告，获得三项专利及一项软著。

课程概要

1. 什么是CRISPR / Cas9?
2. 什么是CAR-T和TCR-T细胞疗法?
3. CRISPR/Cas9在CAR-T和TCR-T细胞治疗中的应用
4. CRISPR/Cas9在其他人类疾病中的应用

现场Q&A

1. Q：CAR-T一般和哪些疗法结合？化疗放疗？ A：很多患者在接受免疫治疗之前已接受了很多传统治疗，包括放疗、化疗以及一些免疫抑制剂等，如果都无效，则会考虑采取CAR-T治疗，而CAR-T治疗过程中也会和免疫检查点抑制剂等疗法进行结合，例如PD-1抗体等。

2. Q：通用CAR-T通常敲除哪几个靶点？
   A：通用型CAR根据其原理需要敲除T细胞本身的内源TCR基因和HLA基因。

3. Q：CAR-T对实体瘤的应用现状如何？
   A：目前上市的药物只有针对血液瘤的anti-CD19 CAR-T，目前CAR-T的临床实验也有针对实体瘤的，但是效果并不十分理想。首先是靶点问题，很难找到针对实体瘤的理想靶点，一般找的靶点是在正常组织中低表达，在实体瘤中高表达的基因，但是这样的靶点会有一些副作用。另外，实体瘤由于免疫抑制性环境抑制非常厉害，所以CAR基本上只能存在于实体瘤表面，无法进入实体瘤内部对其进行杀伤。目前主要是这两个原因限制了CAR-T在实体瘤中的应用，当然还有其他一些免疫细胞自身等的原因。

4. Q：目前免疫治疗对部分患者效果不明显，原因可能是？
   A：这个问题有点大。对于免疫治疗来说，存在特异性，每个个体都不同，每个个体肿瘤类型也不同，面临的治疗也会非常不同，这是一个非常复杂的问题，因为体内环境十分复杂，例如大家都有T细胞，但是T细胞的状态及数量都不同，所以影响治疗反应的原因有很多：1）免疫细胞的状态；2）使用的治疗手段，例如抗原的表达量如何；3）能够进入肿瘤的浸润能力，这些都是影响治疗的原因，需要具体问题具体分析。目前我这个回答只是从大的方面做了一下说明。

5. Q：TMB目前在哪些肿瘤中可靠性高一些？
   A：应用比较成功的应该是黑色素瘤，因为黑色素瘤的TMB是比较高的，使用PD-1的治疗效果相对较好，但是对于一些TMB较低的肿瘤，目前来说效果是不好的。黑色素瘤是一个比较典型的例子。

6. Q：免疫治疗与载药给药系统关联大吗？
   A：载药给药系统：1）如果指的是把CRISPR导入T细胞方面，是有影响的，因为它直接影响编辑效率，从而影响拿到目的细胞的效率和数量；2）而如果指的是T细胞回输入人体方面，这个没有影响，例如血液瘤，回输直接使用静脉输注，是不会受影响的。

7. Q：CRISPR脱靶问题有大改善吗？
   A：CRISPR脱靶就这个单一问题来说，目前有很大改善。有如下改善方式：1）CRISPR家族有很多类型，某些成员在保真性方面是非常好的，可以按需选择。2）对常用的CRISPR酶进行改造，通过突变提高其保真性。3）其他方式，例如改进gRNA长度等，都是有很多手段去改进的。

8. Q：最后部分的ppt介绍B血液疾病的基因治疗用的是慢病毒包装，为什么不采取腺相关病毒呢？
   A：一方面慢病毒包装容量大，且可以长期表达，因为慢病毒是插入基因组内，而CAR是需要长期持续表达的，需要其在体内发挥抗肿瘤的效果。第二个原因，慢病毒在临床上是应用很多的，应用时间也很早，积累了大量实验以及临床数据，这些数据证明慢病毒虽然本质是随机插入，但从目前的临床效果看没有太大的问题，这也是传统疗法使用慢病毒表达的原因，但现在也有很多非病毒的替代系统来做CAR或基因编辑。

9. Q：Cas9 RNP复合物电转方式是否安全？细胞存活率是否过关？临床是否接受cas9 rnp电转这种方式？
   A：安全性是没有问题的，Cas9 RNP本身就属于瞬时转染，把复合物转入细胞，相关蛋白和RNA就发生降解，所以它的off-target会远远低于其他方式。细胞存活方面会有一些影响，RNP是使用电击的技术使复合物进入T细胞，所以很多T细胞会因为电击死亡，这也是需要考虑的因素，因为后续治疗需要考虑细胞量。电转方式本身来说是没有问题的，但是需要考虑如何保证细胞量，细胞量问题解决了，RNP这个方式也没有问题。

10. Q：CAR-T在肺癌治疗中用的多吗？
    A：肺癌的CAR-T治疗有人在做一些临床实验，但是由于靶点及进入肺癌细胞十分困难等问题，所以效果没有很好。肺癌有很多是由于KRAS或EGFR突变引起的，对于这些突变目前已经有一些好的抑制剂，很多患者可以使用相关抑制剂做治疗。其中KRAS也是一个主要的驱动突变，今年有两家公司（安进和Mirati）做了针对KRAS G12C突变的两款抑制剂，初步临床效果比较好。所以目前对于肺癌患者，临床上首先会进行靶向治疗，结合PD-1/PD-L1抑制剂等。一线、二线治疗如果没有效，可以考虑入组细胞免疫治疗的临床实验。

11. Q：如何评价融瘤病毒联用？是免疫治疗嘛？
    A：融瘤病毒是免疫治疗，但是抱歉，由于我本身对融瘤病毒没有深入了解，所以无法对联用做评价。

12. Q：肿瘤新生抗原疗法和CAR-T相比哪个更好？
    A：对于不同免疫疗法的比较不能单纯评价好或者不好，这个需要依具体情况而定。肿瘤新生抗原疗法和CAR-T疗法针对的类型不同。CAR-T主要针对血液瘤，所以如果是血液瘤病人优先选择CAR-T，但是对于实体瘤病人来说，TCR-T或肿瘤新生抗原疗法效果可能会好一些。但是还需要考虑另一个因素，就是肿瘤新生抗原疗法或TCR-T疗法用时会比较久（筛选、验证、回输）。

13. Q：慢病毒介导的Cas9基因编辑，Cas9和sgRNA整合到基因组以后，会一直表达，那么off-target会更高吗？
    A：从本期课程也能看出，CAR基本是用慢病毒来做，但是Cas9基本没有用慢病毒，都是用电转的方式来做，目前常用的都是电转mRA或RNP的方式，就是因为考虑到慢病毒插入基因组会造成很多off-target才没有选择慢病毒介导。

审核：高千千 图片来源：微课页面截图。