Nature子刊 | 空间转录组技术及其发展方向

2022年10月《Nature Biotechnology》发表了一篇空间转录组（ST）技术的综述文章，详细描述了现有的ST技术及其发展方向。

检测生物分子的新技术一直是生物进步的关键驱动力。在检测生物分子时，研究人员在选择实验方法时一直面临着关键的权衡。一方面，“组学”工具可以对纯化样本中的许多生物分子进行广泛而全面的检测。另一方面，一套靶向工具（如免疫染色或原位杂交），可以在完整的细胞和组织中定位特定分子（通常数量较少）。因此，研究项目通常将这两个阶段结合在一起：研究人员首先使用“组学技术”提出假设，然后进行有针对性的、假设驱动的工作，以描述特定基因或蛋白质在感兴趣的完整组织中的作用。

最近ST技术的快速发展正在颠覆这种方法学上的历史分歧。这些工具能够对完整组织切片中转录组的RNA进行量化。广义而言，ST最适合回答三种生物问题：首先可以阐明组织的细胞类型组成；第二类问题与细胞相互作用有关；最后可以帮助阐明组织成分之间的分子相互作用。

ST技术

“基于测序的ST”（sST）

sST技术通常从构建空间索引表面开始，其中每个pixel都包含一个条形码DNA引物，该引物在二维空间中唯一标记pixel的位置。然后将组织放在表面的顶部，通过RNA从组织扩散到表面或条形码引物扩散到组织，使驻留的mRNA与引物接触。通常，在其3′末端带有poly（T）序列的引物用于捕获转录组中的mRNA。常见的方法有10x Genomics Visium、Slide-seq、Stereo-seq 、DBiT-seq等。

在sST中两个最重要的质量参数是单位面积的mRNA捕获灵敏度和mRNA检测的空间精度。此外，测序效率和该技术所覆盖的空间区域也是描述和比较sST技术的附加参数。

“基于成像的ST”（iST）

在iST中，RNA分子通过互补杂交用荧光探针进行特异性标记。然后使用荧光显微镜对这些探针进行成像。为了克服光谱限制，最近的iST方法通常使用多轮连续成像和组合策略来检测转录本。因此，特定的iST方法很大程度上取决于检测方式、RNAs分子的标记方式和多路复用方法，或者通过连续成像轮检测多个RNA转录物的方式。这些方法主要是由三个领域的进展推动的：寡核苷酸合成、荧光显微镜和单细胞转录组学。ST中使用了三种主要的原位标记RNA分子的策略：基于直接探针的检测、基于酶辅助探针的检测和原位RNA分子的直接酶测序。在图像处理中使用三个主要步骤来生成主要ST数据：斑点检测、图像配准和解码为空间mRNA定位。常见的iST技术有smFISH、MERFISH、STARMap等。

在iST中两个关键的数据质量参数是敏感性和特异性。鉴于特定技术的检测、多路复用和图像处理的具体条件，需要评估这些参数。

ST技术的预计开发方向

ST技术的高速进展预示着基因组学正在向完整细胞和组织研究的更广泛技术转变。支持ST（高通量DNA测序、新型条形码策略、新的显微镜工具和分子酶学创新）的工具将越来越多地允许基因组学用于回答细胞和组织生物学中的问题。预计技术开发将在三个主要领域进行：

适用于其他模式

现代基因组学通过酶和生化操作与DNA测序的创造性结合开发了一系列令人印象深刻的生物分子检测技术。然而，大多数技术只能在从组织或细胞中提取和纯化的基质上在体外使用。使基因组学技术在完整组织切片中发挥作用是生物学发现的巨大机会。预计ST技术在量化转录物方面取得的进展将越来越多地应用于其他形式的基因组检测。例如，iST最近被用于通过靶向内含子来量化新生mRNA，这种方法同样可以通过靶向外显子-外显子连接来量化剪接变异。目前，亚型变异的发现需要长读长技术和/或基于平板的方法来评估。未来长读长流程或靶向亚型原位测序的适应应该能实现空间域的可扩展适应。

除了转录组，基因组变异的空间分析已经开始被探索，但工具仍然相对落后。现有的技术主要是通过成像来测量基因组结构，但最近也报道了基于测序的策略。这些技术也可以用于研究表观基因组的修饰和调控，其将在癌症突变分析中应用，基因组变异的空间分析可能有助于阐明体细胞突变与衰老和疾病的功能相关性。

空间方法也可能提供一个机会来统一基因组学和蛋白质组学。尽管基因组学传统上侧重于分离检测，但用亲和试剂对蛋白质定位的查询长期以来一直是在原位低多重性下进行的。最近在亲和试剂（如抗体）的DNA条形码方面的发展，已经通过测序实现了高度多重化的蛋白质readouts。这些方法很容易适应空间域，特别是在空间捕获ST检测的背景下。在不久的将来，整个蛋白质组亲和文库（包括抗体、纳米体和适配体）可以在原位使用和检测。此外，基于邻近性的酶反应，如连接和聚合酶延伸，可以实现组织内高通量蛋白质-蛋白质、DNA-蛋白质和RNA-蛋白质相互作用的测量。最后，利用单分子成像的新型蛋白质测序方法在许多方法上都有了快速发展；有一天，这可能会允许在组织中直接进行蛋白质测序。

提升分辨率

当前的空间基因组方法涵盖了从组织区域到亚细胞定位的广泛空间分辨率，在组织的体积通量和收集的数据空间分辨率之间进行了总体权衡。不同的空间分辨率适用于不同类别的生物问题。对测量的转录物进行细胞分割的能力对于许多下游应用至关重要，例如量化细胞类型和组织组成。在sST和iST中，分割都是一个计算问题。对于sST，它涉及从一个pixel对细胞型混合物的去卷积；当pixel大小减小到单个细胞的大小时，问题就简单多了。对于iST，计算任务是从显微镜图像中将单独检测到的转录物组装成细胞。这两方面的努力都取得了进展，但额外的计算创新将大大加快ST工具应用于组织生物学问题的能力。

在组织组成之后，提高分辨率将使组织组成能够考虑到细胞间的相互作用。基本问题包括如何提取构成组织的相关细胞网络？而且，如何发现细胞之间的功能性受体-配体相互作用网络？这些问题最适合具有细胞分辨率或更高分辨率的技术，以便能够将分子特征准确分配给相互作用的细胞网络。

此外，能够实现生物分子精确原位共定位的技术（可能在超过衍射极限的分辨率下）仍然几乎完全未被探索。一个有趣的例外是几个小组提出使用具有局部连接的原位PCR扩增来检测两个核酸之间的空间接近度。从转录因子结合位点的定量到生物分子共定位到特定的细胞器隔室或间隙连接或其他细胞-细胞相互作用的定量，原位分子共定位的方法将在生物学上具有极大的可行性。

细胞动力学的观察

空间基因组技术和合成基因操作方法在分子记录方面的交叉尤其有前景。最近，已经描述了许多基于基因编辑的分子记录技术，这些技术将谱系和信号动力学编码到基因组序列中。这些方法利用单细胞测序来读取基因组信息。鉴于单细胞和sST 之间化学性质的内在相似性，谱系的基因组记录可以很容易地转化为组织环境。这种测量对于发育生物学很重要，其中有关细胞谱系、细胞状态和成人组织组成的信息可以同时组合以形成发育图谱。在肿瘤进化中，这些方法可以回答有关肿瘤克隆的空间异质性以及肿瘤克隆适应度与细胞微环境之间关系的重要问题。除了谱系之外，新的记录技术开始对细胞历史和转录组状态进行编码，这可能为使用基因组学对细胞状态进行全四维测量提供了希望。

关于动力学的计算推断，最近用于单细胞研究的计算工具数量激增，例如伪时间和RNA速度。针对单个细胞开发的方法已成功应用于ST数据，例如将RNA速度应用于发育中的小鼠皮层ST。然而，未来面向空间的计算动力学工具箱的开发将更直接地利用ST数据的独特方面。人们可以利用RNA的亚细胞定位来推断有关动力学的额外时间信息。更重要的是，空间信息可以在伪时间分析中提供背景事实，例如使用细胞定位来分配细胞轨迹中的节点。

最后，扰动允许从点测量中推断因果关系。最近的方法使核酸条形码能够对单细胞readouts的遗传和化学扰动进行编码。与分子记录类似，扰动条形码方法可能与空间捕获方法固有地兼容。此外，通过原位测序读取条形码已被证明可用于成像方法。使用 ST 分析原位遗传扰动的影响将能够分析在没有组织背景的情况下无法访问的表型。这些表型很多，包括细胞定位和细胞-细胞相互作用。

由于篇幅有限，更多技术细节可参考文献原文：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01448-2

参考文献Tian, L., Chen, F. & Macosko, E.Z. The expanding vistas of spatial transcriptomics. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01448-2图片均来源于参考文献，如有侵权请联系删除。