首个使用大规模平行测序技术进行胎儿染色体异常的分子标记研究

外泌体是直径50-100纳米的细胞外双层膜囊泡，并携带如CD9、CD63和CD8等跨膜蛋白标记物，是细胞间通讯的载体之一。人类孕期胎盘滋养外胚层细胞可释放外泌体（exosomes）进入母体外周循环，且浓度与妊娠周数呈正相关。在肿瘤诊断方面，已有使用外泌体DNA（exoDNA）进行肿瘤相关基因检测研究。而在母婴研究方面相关报道较少。已知滋养层细胞亦产生游离DNA（cfDNA）并已成熟应用于的无创产前染色体非整倍体筛查。该研究进行了外泌体DNA（exoDNA）与cfDNA在基因组分布、片段长度和检测遗传疾病等方面的比较研究，以期填补该方面的研究空白。

研究方法

该研究选择20例正常妊娠、9例T21妊娠、3例T18妊娠期、1例T13妊娠和2例FGFR3突变妊娠样本的外周血，提取exoDNA并使用BGISEQ-500进行exoDNA与cfDNA大规模平行测序（massively parallel Sequencing，MPS）比较分析。

孕妇外周血exoDNA含量

该研究使用Q-PCR与△Ct值分析孕妇外周血中exoDNA含量，发现20例正常妊娠样本中均可检测出exoDNA信号，且含量低于cfDNA；并且Q-PCR成功检查到上述样本中Y染色体信号（即性别鉴定）。

exoDNA基因组分布

为了进一步检测exoDNA分子特性，该研究进行了低覆盖率的MPS测序，获得7.7M无重复测序读长数据（覆盖率0.25X）。经过比较研究发现，exoDNA与cfDNA均可比对至人染色体组，两者变异系数（coefficient of variation，CV）无统计学显著差异（P=0.125）；exoDNA GC含量高于cfDNA（1.16倍）；线粒体DNA含量（mtDNA）高于cfDNA（2.18倍，p<0.001）。上述研究结果均表明两者之间有相似的分子特征。

该研究结果表明:

exoDNA与cfDNA在基因组分布、高GC含量等方面相似；exoDNA与cfDNA相比片段更短且胎儿分数评估（fetal fraction）更低；exoDNA可准确预测胎儿性别、染色体非整倍体（三体）和FGFR3 突变。母体外周血中的exoDNA表现出与cfDNA相似的特征，在进行胎儿遗传性疾病无创诊断方面具有重要的临床潜质。并且该研究属于首个使用大规模平行测序技术进行孕妇外周血外泌体DNA（exoDNA）作为胎儿染色体异常的分子标记研究。该研究数据量为112.71Gb，全部存储于国家基因库生命数据大平台，访问编号为：CNP0000205。

exoDNA与cfDNA片段长度与胎儿分数评估分析

在全部样本测序结果中，cfDNA片段中位长度为 168.5bp±1.25bp，而exoDNA中位长度为 152.4bp±10.51bp，片段更短，且弥散程度（dispersive distribution）更明显。然后使用chrY进行胎儿分数分析，exoDNA与cfDNA大体一致但分数值更低。

exoDNA用于胎儿染色体非整倍性及单基因遗传疾病预测分析

该研究分析了来自T21妊娠、T18妊娠、T13妊娠和对照组20例正常妊娠的exoDNA，使用T-test和Z-score进行分析，结果表明exoDNA可成功检测出上述3种阳性样本。

随后，该研究还进行了exoDNA对胎儿单基因疾病的诊断分析。该研究试图从常染色体显性疾病患者样本（软骨发育不全（achondroplasia，ACH）和致死性骨发育不全（thanatophoric dysplasia，TD）中发现新突变位点。对样本中FGFR3基因编码区进行PCR+MPS分析，研究发现c.1138G>A 和c.742C>T两个新的点突变。这些检测结果与羊水穿刺结果一致。

讨论

该研究证实了孕妇外周血中exoDNA的存在，并从多个方面分析了exoDNA的分子特征，在一些关键特征上与cfDNA十分相似，该研究推断exoDNA可能是cfDNA来源之一，并通过一些列的比较研究，发现exoDNA在染色体非整倍性和单基因遗传疾病检测方面与cfDNA有几乎对等效力，有理由推测exoDNA在非侵入性产前诊断方面具有重要的临床价值。

该研究属于首个使用大规模平行测序技术进行孕妇外周血外泌体DNA（exoDNA）作为胎儿染色体异常的分子标记研究。

此外，除了exoDNA进行产前检测，因外泌体带有跨膜蛋白标记，还可以在免疫亲和研究等方面发挥作用，具有潜在的生物学活性诊断用途。

引用

1. Weiting Zhang. et al. Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy and single gene disease by shotgun sequencing of placenta originated exosome DNA: a proof-of-concept validation. doi: https://doi.org/10.1101/464503