科学家将基因编辑工具提升到人类干细胞的新高度

科学家将基因编辑工具提升到人类干细胞的新高度。在过去的十年里，基因编辑工具CRISPR改变了生物学，为纠正致命的遗传性疾病开辟了充满希望的途径。去年秋天，科学家们开始了首次利用CRISPR防治癌症等疾病的人体临床试验。他们取出一个人的部分细胞，CRISPR编辑DNA，然后将细胞重新注入，希望能治愈疾病。

科学家将基因编辑工具提升到人类干细胞的新高度

但伴随着这种再生、个性化医学的承诺，CRISPR也会有很大的安全限制。CRISPR可能不会编辑在正确的地方（所谓的脱靶基因效应），或者不是非常高效（对于每一个可用的细胞靶点，可能只有大约10%的时间可以成功编辑）。

这些局限性让亚利桑那州立大学的细胞生物工程学家David Brafman等科学家感到沮丧。Brafman最初的希望是利用基因编辑技术，在他的实验室中发现阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病研究的核心原因。

"我们研究阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病，并利用干细胞研究与阿尔茨海默氏症相关的特定突变或风险因素，"ASU的Ira A. Fulton工程学院的生物医学工程教师Brafman说。"我们不一定是一个基因编辑工具开发实验室，但我们在使用传统的基于CRISPR的编辑方法生成干细胞系时遇到了困难。由于尚不清楚的原因，干细胞对那种基因修饰真的很抗拒。"

绿灯意味着出发

现在，Brafman利用最初在哈佛大学David Liu实验室开发的CRISPR碱基编辑技术的新更新，对人类干细胞进行高度精确的单DNA碱基编辑，效率高达90%，大大超越了之前的努力。该成果发表在《干细胞报告》杂志上。

"以前，使用CRISPR，只是随机猜测，"B拉夫曼说。"因此，如果你随机挑选干细胞，而且效率很低，你很可能只得到10%或5%，因为你不知道是否已经进行了编辑--细胞没有告诉你。"

Brafman的实验室开发了一种新的TREE方法（编辑富集的瞬时报告器的缩写，简称TREE），它可以批量富集DNA碱基编辑的细胞群--------并首次在人类干细胞系中实现了高效率。

""大多数研究都是在永生化细胞系或癌症细胞系中进行的，这些细胞系相对容易编辑，"Brafman说。"这是第一个在多能干细胞中使用碱基编辑器的例子，这是一个非常有价值的细胞群，可以进行遗传修饰。我们设想这种方法将对人类干细胞系在发育生物学、疾病建模、药物筛选和组织工程应用中的使用产生重要影响"。

去年，他们已经证明了他们的TREE方法可以在人类细胞系中发挥作用，但他们希望进一步推动这项技术，找到一种快速高效编辑人类干细胞系的方法。

与CRISPR不同，他们的TREE方法只在DNA上做一个单链缺口，而CRISPR则是横切两个DNA支架。例如，当单个DNA碱基从C成功编辑成T时，蛋白质会发出信号，从蓝色变成绿色。

"现在，如果一个细胞告诉你，'如果我在发光的绿色，我有90％的机会被编辑，你将有更好的运气来识别被编辑的人群，"B拉夫曼说。"然后，你可以排除所有没有被编辑的细胞。我们分离出发绿光的单细胞，然后将这些细胞培养成克隆种群，你能够无限扩大。"

针对阿尔茨海默氏症

多能干细胞之所以受到再生医学的重视,是因为它们有能力成为或分化成人体的任何细胞类型。

Brafman解释说，一般有两个来源，"胚胎干细胞，是从植入前囊胚的内部细胞团中提取的，还有就是诱导多能干细胞，从患者身上提取体细胞，如皮肤或血液。"

Brafman的实验室使用诱导多能干细胞进行研究。

"在这项研究中，我们使用了来自健康患者的多能干细胞，然后是阿尔茨海默病患者。我们有兴趣调控的一些基因与阿尔茨海默病有关。大多数患有阿尔茨海默病的患者都是晚期发病，或者是散发性阿尔茨海默病。"

为了提供概念证明，他们将APOE基因作为目标，APOE基因可以有三种口味。三种基因变体中的一种，称为APOE4，与晚发性阿尔茨海默病的高风险有关。在这项研究中，他们将基于单DNA的编辑引入APOE基因中。

"这就是为什么我们对这些细胞感兴趣，"Brafman说。"它们是中枢神经系统中的神经元和各种细胞类型的代表，有这些各种风险因素的患者。然后，我们可以了解为什么APOE变体可以增加或降低风险，然后我们可以开始瞄准那些受影响的途径。"

TREE不仅可以对APOE4基因进行单次DNA编辑，而且与CRISPR不同的是，可以对人类拥有的APOE4基因的两个拷贝进行高度精确的修正。

"传统的CRISPR方法是，你必须编辑一次以获得一个杂合编辑 ，然后分离该克隆，再次编辑以获得另一个杂合编辑，"Brafman说。"所以，这种方式的效率很低。我们生成同种编辑的效率接近90%。我还没有看到任何其他技术可以在多能干细胞中做到这一点。"

此外，TREE还可以用于将关键基因敲除突变工程化到干细胞系中。"如果一个基因对疾病、发育或生理学有重要影响，你能做的最基本的实验就是敲除它，"Brafman说。这就打开了一大堆我们可以解决的问题。以APOE作为案例研究，现在我们可以在这些细胞中敲除APOE，如果你根本没有APOE。它是有益的吗？有害的？还是没有区别？"

复杂的案例

虽然像镰状细胞贫血或囊性纤维化这样的疾病是由DNA中的单一突变引起的，对于大多数疾病和死亡的主要原因，如心脏病或高血压，是复杂的，并涉及多个基因。布拉夫曼希望也能解决阿尔茨海默症的复杂、根本原因。

"尤其是与阿尔茨海默病有关的，可能有多种风险因素协同作用，所以我们希望有一种方法在多能干细胞中同时引入多种编辑。因为否则,你将不得不采取这种顺序迭代的方法,你引入一个编辑,分离出一个克隆群体,引入另一个编辑,等等。

他们成功地证明,TREE可以用来制造新的干细胞系,这些干细胞系同时在多个基因位置进行了编辑。他们的结果显示，超过80%的干细胞克隆已经在所有三个不同的基因位点上被定位，并且所有克隆都编辑了两个基因拷贝。

"我们发现，如果你多路复用，你仍然可以获得与你只编辑单个等位基因相同的编辑效率，"Brafman说。"现在，我们可以使用这些细胞作为体外模型来研究疾病和筛选药物。"

Brafman希望他们的新工具能在基因编辑界引起兴奋，并刺激其他人继续做出新的发现。

科学家将基因编辑工具提升到人类干细胞的新高度，"我们希望不断扩大这个工具箱，"B拉夫曼说。"我们已经得到了其他科学家的高度兴趣，他们将用这个来生成自己的细胞系。这是件好事。"

引用

Arizona State University. "Scientists boost gene-editing tools to new heights in human stem cells." ScienceDaily. ScienceDaily, 30 January 2020. www.sciencedaily.com/releases/2020/01/200130144531.htm.