2021-09-23 1481CNGBdb
2021年8月23日,华大基因唐冲博士团队在表观遗传与染色质研究权威期刊Epigenetics & Chromatin上发表题为"Sequencing of methylase-accessible regions in integral circular extrachromosomal DNA reveals differences in chromatin structure"的论文,开发出一种单分子层级研究ecDNA染色质开放性的新技术 —— CCDA-seq。
此项研究中Nanopore平台原始测序数据已存储于国家基因库生命大数据平台(CNGBdb),项目编号为:CNP0001720。
*上述研究数据为受控数据。如有下载需求请向国家基因库数据受控中心(CDA)申请授权。
最近几年的研究表明,染色体外环状DNA(ecDNA)可以促进癌基因扩增,驱动肿瘤进化,并具有遗传异质性,在癌症发生中发挥着关键作用[1,2,3,4]。但由于缺乏足够的分子分析技术,尽管ecDNA自1964年以来就已为人所知,对其具体作用的阐明却一直进展缓慢。
目前的研究主要通过拷贝数变异(如Amplicon Architect)[5]和识别ecDNA junction位点(如Circle-Map和CIRC_finder)[6,7]等方法从测序数据中识别ecDNA。但是对ecDNA功能表观遗传学的研究还很缺乏。而了解全基因组范围ecDNA的染色质状态和转录状态是至关重要的,有助于促进对ecDNA及其在癌基因表达中的作用的深层认识。
用传统的ATAC-Seq和Chip-Seq等方法进行ecDNA研究时需要将DNA打断,进行短片段测序,配合的计算方法大部分是通过检测junction位点来识别ecDNA,所以只能揭示邻近junction区域的染色质可及性和DNA结合蛋白修饰,而不能提供完整的ecDNA染色质状态以及中远端调控元件之间的关系。另外,传统方法的数据分析基于peak calling策略,无法提供单分子级的ecDNA结构和表观遗传信息,所以也无法获得不同状态下ecDNA分子的表观异质性。近两年,基于单分子长读长测序方法开发的nanoNOMe-seq[8]、SMAC-seq[9]和Fiber-seq[10]技术,可以同时获得单个DNA分子的碱基信息和甲基化信息,已经在单分子表观遗传异质性与调控元件远端互作方面取得了应用,但在ecDNA领域还未见报道。
该研究利用m6A MTase甲基转移酶对基因组DNA进行处理,获得单分子水平的染色质开放性区域的m6A DNA甲基化修饰((图1A)。为了提高ecDNA捕获效率,该方法还引入外切酶去除线性基因组DNA并通过纳米孔测序对完整的ecDNA进行测序。对生成的数据,首先通过junction序列识别ecDNA分子,并动态地将序列片段映射到基因组中(图1B)。基于junction的位置,重新组装部分ecDNA序列作为新的参考,并根据重组后的ecDNA序列识别出m6A信号,以防止juction区域的信号产生偏差,并且重构了完整的ecDNA(图1B)。
为了提高m6A甲基化判读的准确性,该方法增加了阴性样本进行m6A甲基化的识别,通过高斯混合模型对calling的概率值分布进行拟合,去除了背景噪声(图2)。并且通过与DNase-seq进行比较,CCDA-seq与DNase-seq数据在高表达基因的转录起始位点周围显示了相似的核小体模式,在不同分辨率的基因组尺度上也具有高度的一致性(图3、图4)。测序reads长度在10到100 kb之间,比传统ATAC-seq中观察到的Junction区域宽50倍(图5)。
进一步,通过比较ecDNA和同源线性DNA的平均染色质可及性,发现ecDNA染色质的可及性大部分是高度开放的,并且比线性DNA的染色质可及性更高,强化了ecDNA扩增会导致更高的致癌基因转录的普遍观点。(图6)RNA-seq数据分析显示,ecDNA高表达基因340个(25% rank),中表达基因464个(25-75% rank),低表达基因589个(75%-100% rank),说明并不是所有的ecDNA基因都是高表达的(图7)。通过分析转录起始/终止位点的附近的染色质可及性信号,CCDA-seq准确定位到NDR (nucleosome depletion regions)(图8)。
为了进一步探索ecDNA的功能,该方法对ecDNA单分子数据进行组装,重构出完整ecDNA,并且ecDNA上携带完整的致癌基因。如TSG101 (Tumor Susceptibility Gene 101.), 对ecDNA上的基因进行Gene Ontology分析显示富集到与癌症显著相关的通路,如GTPase activator activity。
CCDA-seq 提供了单分子分辨率下数千碱基长度的染色质状态,通过比较ecDNA和线性基因组DNA中的单分子水平的染色质信号分布,观察到线性DNA和ecDNA中的多种染色质可及性状态,线性DNA (chr10: 4238321 - 42389251)的染色质结构采用两种不同的构象:一种是核小体不活动状态,另一种是由于极高的转录活性而基本缺乏核小体的状态,而ecDNA中观察到具有高度异质性的核小体耗尽/占据模式,在bulk ATAC-seq中则无法获得不同状态下分子的表观异质性(图11)。
接下来,通过评估核小体定位相关性研究了ecDNA和线性基因组DNA的共可及性模式,与线性DNA相比,ecDNA中的核小体具有更高的相关性,并且ecDNA中的作用距离更远,表现出远程染色质相互作用(图12)。
总体来说,利用CCDA-seq,观察到了开放染色质区域中ecDNA的多样性,在数千碱基长度尺度上定位到了核小体的分布,以及量化了单分子分辨率下远端调控元件的染色质状态的相关性,揭示了单分子水平线性DNA与ecDNA不同的染色质状态。CCDA-seq有助于更全面地了解ecDNA表观基因组的调控,为ecDNA调控的独特机制提供深入的见解。
参考文献
[1] Wu S, Turner KM, Nguyen N, Raviram R, Erb M, Santini J, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575(7784):699-703.
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[3] Paulsen T, Kumar P, Koseoglu MM, Dutta A. Discoveries of Extrachromosomal Circles of DNA in Normal and Tumor Cells. Trends Genet. 2018;34(4):270-8.
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[9] Shipony Z, Marinov GK, Swaffer MP, Sinnott-Armstrong NA, Skotheim JM, Kundaje A, et al. Long-range single-molecule mapping of chromatin accessibility in eukaryotes. Nat Methods. 2020;17(3):319-27.
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[11] Chen, W., Weng, Z., Xie, Z. et al. Sequencing of methylase-accessible regions in integral circular extrachromosomal DNA reveals differences in chromatin structure. Epigenetics & Chromatin 14, 40 (2021).
信息及图片来源:Epigenetics & Chromatin官网和“华大科技BGITech”公众号。